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一、孔雀石綠快速檢測試劑盒原理

本試劑盒采用間接競爭(zheng)  ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物孔雀石綠將和 微孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗孔雀石綠抗體(ti) ， 加入酶標記物後，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值 與(yu) 其所含殘留物孔雀石綠的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準 曲線比較即可得出相應殘留物孔雀石綠的含量。

二、孔雀石綠快速檢測試劑盒特性

試劑盒靈敏度：  0.05ppb

孵育溫度：    25℃

孵育時間：    30min～30min～15min

樣本檢測限

水樣 ———————— 0.1ppb

水產(chan) 品 ·——————+—— 0.5ppb

• 交叉反應率

• 樣本回收率

水樣、水產(chan) 品 ————————  80%~110%

• 精密度

板內(nei) 、板間變異係數≤12%

三、試劑盒組成

四、所用儀(yi) 器、試劑

具備的儀(yi) 器：酶標儀(yi) 、均質器、振蕩器、離心機、 刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮 吹儀(yi) 、恒溫箱微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl

試 劑：乙腈、二氯甲烷、無水硫酸鈉、正己烷

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試 劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨， 必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實 驗結果。

 樣本前處理需配製： 配液 1 樣品提取液乙腈-二氯甲烷混合溶液：

V 乙腈-V 二氯甲烷 = 4 : 1，取 40ml 乙腈， 再加入 10ml 二氯甲烷，混勻後使用。

配液 2 樣品複溶液

將 4X 濃縮複溶液用去離子水按 1：3 稀釋 （1 份 4×濃縮複溶液+3 份去離子水），或按所需用 量配製。

 樣本處理：

（a）水樣處理方法

取 50µl 清澈水樣樣直接測定（如果水樣渾濁 一定要過濾或 4000r/min 離心 10min，直至得到 清澈樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。

樣本稀釋倍數:  1 倍

（b）水產(chan) 品處理方法

1、稱取 2±0.05g 均質組織樣品於(yu)  50ml 離心管中， 加入 6ml 樣品提取液（配液 1），2g 無水硫酸 鈉，振蕩 5min ，室溫（25℃左右）4000r/min以上離心 10min；

2、取 3ml 上清液，加入 20µl 氧化劑，搖勻，在 56℃ 條件下氮氣或空氣流吹至*幹燥；

3、加入 1ml 正己烷，加入 1ml 樣品複溶液（配液2），振蕩搖勻 1min，4000r/min 以上離心 5min；

4、取下層 50 µl 用於(yu) 分析；

樣本稀釋倍數:  1 倍

注：此方法所得到的結果為(wei) 孔雀石綠；隱性孔 雀石綠；結晶紫；隱性結晶紫的總量。

六、酶標免疫分析程序:

測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 （20～25℃）。

2、 使用之後立即將所有試劑放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決(jue) 於(yu)  洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜 蓋住微孔板。

操作步驟：

1、從(cong)  2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～ 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體(ti) 試劑使 用前均須搖勻。

2、取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放 入自封袋，保存於(yu)  2-8℃。

3、配液 1：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去 離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份 去離子水），或按所需用量配製洗滌液。

配液 2：

配製孔雀石綠標準液：取一定量的 10 倍濃縮

標準液用樣品複溶液 10 倍稀釋，現配現用， 具體(ti) 如下：

標準液6：配製4.05ppb 標準液--取50ul 40.5ppb標準液加 450ul 樣品複溶液混勻；

標準液5：配製1.35ppb 標準液--取50ul 13.5ppb標準液加 450ul 樣品複溶液混勻；

標準液 4：配製 0.45ppb 標準液--取 50ul 4.5ppb標準液加 450ul 樣品複溶液混勻；

標準液 3：配製 0.15ppb 標準液--取 50ul 1.5ppb標準液加 450ul 樣品複溶液混勻；

標準液 2：配製 0.05ppb 標準液--取 50ul 0.5ppb標準液加 450ul 樣品複溶液混勻；

標準液 1：配製 0ppb 標準液--取 50ul 0ppb 標準液加 450ul 樣品複溶液混勻；

4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每 個(ge) 樣本和標準品做 2 孔平行，並記錄標準孔和 樣本孔所在的位置。

5、加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然後加 入抗體(ti) 工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振 蕩混勻。25℃環境中反應 30min。

6、將孔內(nei) 液體(ti) 甩幹，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔 洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙 拍幹（拍幹後未清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺 破）。

7、每孔加入酶標記物 100µl，蓋板膜蓋板後置25℃ 環境中反應 30min。將孔內(nei) 液體(ti) 甩幹，用洗滌 液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍幹（拍 幹後未被清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺破）。

8、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯 色 15min。

9、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設 定酶標儀(yi) 於(yu)  450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nei) 讀數），測定每孔 OD 值。

七、結果判定

結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第 1 種方 法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與(yu) 其所含孔雀石綠量成負相關(guan) 。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出 其濃度範圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為(wei)  0.3， 樣本 2 的吸光度值為(wei)  1.0，標準液吸光度值分別是：

0ppb 為(wei)  2.243；0.05ppb 為(wei)  1.816；0.15ppb 為(wei)  1.415； 變質。

0.45ppb 為(wei)  0.74；1.35ppb 為(wei)  0.313；4.05ppb 為(wei)  0.155。  8、該試劑盒佳反應溫度為(wei)  25℃，溫度過高或過則樣本 1 的濃度範圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2的濃度範圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應的稀 釋倍數即為(wei) 樣本中孔雀石綠實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分 吸光率等於(yu) 標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙 孔）除以*個(ge) 標準（0 標準）的吸光度值，再乘 以 100%，即

B

百分吸光率（%）＝ ×100% B0

低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲(chu) 藏條件和保質期

1、儲(chu) 藏條件：試劑盒於(yu)  2-8℃保存，不要冷凍。 2、保 質 期：該產(chan) 品有效期為(wei)  1 年，生產(chan) 日期見

包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正 常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪製與(yu) 計算 以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以孔雀石綠標準品濃度（ng/ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲 線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標 準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀 釋倍數即為(wei) 樣本中孔雀石綠實際濃度。

若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

1、室溫低於(yu)  25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會(hui) 導致所有標準的 OD 值偏低。

2、在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會(hui)  伴隨著標準曲線不成線性，重複性不好的現象。 所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會(hui) 出現重複性不好的現象。

4、反應終止液為(wei)  2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜 使用會(hui) 引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用 不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質 和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴 露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標 準品 1 的吸光度值小於(yu)  0.5 時，表示試劑可能