| 更新時間： | 2025-02-18 |
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| 廠商性質： | 生產廠家 |
提供商: 上海研謹生物服務名稱: 基因克隆服務規格: 實驗服務 價(jia) 格： 2000元收費標準/服務周期/提供結果:歡迎谘詢詳談，我們(men) 會(hui) 根據您的方案及需求製定詳細的服務協議。更多實驗技術服務請瀏覽網站其他內(nei) 容,或來電詳詢!
基因克隆
一.目的基因的獲得
目的基因是指所要研究或應用的基因,也就是將要克隆或表達的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中重要的一步。目前用於(yu) 獲得目的基因的方法有幾種，如限製性內(nei) 切酶直接分離法、文庫篩選法、體(ti) 外擴增法和人工合成法等，其中限製性內(nei) 切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈式反應(PCR) 或逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR) 體(ti) 外擴增目的DNA--片段是目前常用的方法。
(一)采用限製性酶切法直接分離目的基因
1、從(cong) 原核基因組中製備原核基因組相對較小，用幾種限製性內(nei) 切酶分別消化原核基因組，或用某種限製性內(nei) 切酶對所要研究的基因組進行部分消化，可以得到大小不等的各種片段，其中有些片段就會(hui) 含有目的基因，將這些片段插入載體(ti) 中進行克隆，經過篩選，可以得到所需的目的基因。
2.從(cong) 真核基因組中製備真核基因組比較大，直接用限製性內(nei) 切酶消化後需要篩選的克隆數太多，不易操作。可以用一種限製性內(nei) 切酶先消化基因組DNA,產(chan) 生連續的DNA--片段，然後電泳分離這些DNA--片段，再用-段特異探針與(yu) 這些DNA--片段進行雜交，在含有特異性模板的區域就會(hui) 出現雜交帶，可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。我們(men) 也可以將酶切後的基因組DNA--片段全部克隆入適當的載體(ti) 中，製成基因組文庫，再用特異性探針與(yu) 基因組文庫中的不同克隆進行雜交，陽性克隆即示克隆到的DNA--片段含有特異基因序列。將陽性克隆測序，用第--個(ge) 克隆片段的末端分離下一個(ge) 克隆片段，然後利用DNA--片段間的重疊順序來鑒定其他克隆。這樣一步步走下去，終可得全部基因序列，這種技術叫做染色體(ti) 步移(chromosome walking)。
(二)采用PCR或RT-PCR方法製備目的基因
1.根據已發表的基因序列設計並合成引物，采用PCR (以基因組DNA為(wei) 模板)或RT-PCR (以mRNA為(wei) 模板)從(cong) 組織或細胞中獲取目的基因片段用於(yu) 基因操作，這是實驗室中常用的獲取已知基因的方法。
2.利用PCR獲取目的基因的一大優(you) 點就是可以根據需要在引物序列上設計適當的酶切位點起始密碼子或終止密碼子等，或通過人為(wei) 錯配改變堿基序列(人工突變)對目的基因進行有限修飾。對於(yu) 未知基因，可采取構建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因:利用mRNA末端poly A序列尾設計共用引物，將所有mRNA逆轉錄成cDNA.利用各種工具酶在cDNA末端加尾,然後采用一對共用引物擴增所有cDNA--片段，將經PCR擴增後的片段插入到適當載體(ti) 中，構建成PCR-CDNA文庫。這種方法的優(you) 點是可以將表達水平很低的mRNA擴增出來，有利於(yu) 篩選出表達豐(feng) 度低的基因。由於(yu) 經過PCR擴增，基因序列的精que確性需要采用其他方法進一步確定。
3.還有一個(ge) 獲得目的基因的方法是利用計算機技術進行計算機克隆。即利用GenBank中的基因信息，通過軟件比較不同種屬基因之間的相似性(同源性)，利用保守區序列設計引物， 再用PCR或RT-PCR從(cong) 不同種屬或不同組織細胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實現的一種獲得新基因的捷徑。
(三)基因組文庫或cDNA文庫的構建和篩選
1.將基因組DNA用限製性內(nei) 切酶消化後插入到適當載體(ti) 中，得到含有不同插入片段的克隆載體(ti) ，這種克隆載體(ti) 的混合物含有長短不同的基因組片段，這就是基因文庫。若將細胞內(nei) 所有mRNA均逆轉錄成cDNA,然後將所有cDNA--片段克隆到適當的載體(ti) 中，構建成含有不同cDNA--片段的克隆載體(ti) 混合物，這就是cDNA文庫。目前許多組織或細胞的基因組或cDNA文庫都可以從(cong) 商業(ye) 公司買(mai) 到。
2.當獲得了基因組文庫或cDNA文庫，可以根據已知的信息合成特異性探針，采用核酸分子雜交的方法從(cong) 文庫中篩選感興(xing) 趣的基因片段，這仍是目前獲得新基因的一種常用手段。基因組文庫或cDNA文庫的構建和使用請參見本書(shu) 相應的章節。
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