| 更新時間： | 2025-02-18 |
| 訪問量： | 2218 |
| 廠商性質： | 生產廠家 |
提供商：上海研謹生物/杭州研謹生物服務名稱： 探針合成實驗步驟規格：實驗服務 價(jia) 格：3000元
探針合成實驗步驟
探針是- -小段單鏈DNA或者RNA*片段(大約是20到500 bp)， 用於(yu) 檢測與(yu) 其互補的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成為(wei) 單鏈，隨後用放射性同位素(通常用磷-32)、螢光染料或者酶 (如辣根過氧化物酶)標記成為(wei) 探針。
實驗材料 | 基因 |
試劑、試 劑盒 | 轉錄緩衝(chong) 液DTT RNA酶抑製劑CTP ATP S-UTP乙酸銨乙醇 |
儀(yi) 器、耗 材 | 水溶鍋、離心機、培養(yang) 箱、烘箱 |
實驗步驟 | 1.在一個(ge) 含SP6. T3或T7啟動子的載體(ti) 中，插入目的基因。在編碼序列下遊酶切使質粒呈線 性。DNAL以酚/氨0仿抽提， 乙醇沉澱，70%乙醇洗後晾幹。以無菌水重溶沉澱至1 ug/ul。 2.室溫配置如下反應混合液(總體(ti) 積20μl) : (1) 4.0 ul 5x轉錄緩)衝(chong) 液 (2) 0.2 ul 1 mol/ DTT (3) 60 U RNA酶抑製劑 (4) 1.0 ul三種10 mmol/l NTP中的每-種 (5) 1.0 ul 1 ug/ul酶切DNA (6) 10.0μ ζ[35s] UTP (7) 16 U SP6或T7 RNA聚合酶 (8) 37*C溫育30 min,再加16 U聚合酶並於(yu) 37 °C溫育40 min。 3.在反應混合液中加入: 60 U RNA酶抑製劑，20 μl 10 mg/ml的載體(ti) RNA和1.0μl酶1,於(yu) 37°C溫育10 min以除去摸板。 4.往反應混合液加入以下液體(ti) : 0.8 ul 1 mol/l DTT. 63 μul 無菌水和10 μI3 mol/l乙酸鈉，取出1 ul測定其cpm/ul值。 5.加36.4μ7.5 molM的乙酸銨於(yu) 反應混合液(終濃度2 mol/)加50~100 ug tRNA載體(ti) 和272ul冷無水乙醇，置幹冰上沉澱10 min,以冷70%乙醇洗沉澱，晾幹，需要的話可重複此步。以100μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉澱。 6.確定其cpm/μl值， 並計算摻入百分比，核糖核酸探針應於(yu) 2~3天內(nei) 使用。 (70%到90%的標記摻入，結果可得70~90 ng標記的RNA) |
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