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操作說明 細胞分離液試劑盒操作說明：：：：

Store at：：：RT 試劑盒規格：：：：2×100ml/Kit

猴胰島細胞分離液試劑盒：

貨號                     品牌              產(chan) 品名稱          規格         報價(jia)

全血及組織稀釋液 100ml

細胞洗滌液 100ml

試劑 B 100ml

試劑 D 100ml

說明書(shu) 1 份

一、、、、分離方法說明及圖例

A. 在 10ml 或 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 B、D 兩(liang) 種液體(ti) 各 2ml,製成梯度界麵（各液麵分層一定要清晰）；

B．取 1ml新鮮抗凝血與(yu) 全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）1：1混合並小心加於(yu) D液之液麵上；或取組織勻漿單細胞懸液（細胞濃度為(wei) 2×108-1×109個(ge) /ml，具體(ti) 製備方法參照

“二、組織單細胞懸液的製備”）小心加於(yu) D液之液麵上；

C. 以400g（約1500轉/分）離心15分鍾(半徑15cm水平轉子)；

此時離心管中由上至下細胞分為(wei) 五層。*層；為(wei) 血漿層或組織勻漿液層。第二層；為(wei)

富含胰島細胞的 D 液層。。。。第三層；為(wei) 單個(ge) 核細胞層。第四層；為(wei) 透明 B 液層。第五層；為(wei) 紅細胞層。收集第二層富含胰島細胞的 富含胰島細胞的 富含胰島細胞的 D 液層放入含 4-5ml 細胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻後，以 500g（約 1800 轉/分）離心 20 分鍾，棄去上清留沉澱細胞重新懸起。重複洗滌 2 次即得所需胰島細胞。

注：：：：A. 提取率約為(wei) 80%。

注：：：：A.. .. 本說明隻提供機械勻漿製備單細胞懸液的方法 本說明隻提供機械勻漿製備單細胞懸液的方法 本說明隻提供機械勻漿製備單細胞懸液的方法，，，，酶消化法由於(yu) 各實驗室選取的消化 酶消化法由於(yu) 各實驗室選取的消化酶種類各不相同， 酶種類各不相同，，，請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗。。。。全過程及所需試劑要求無菌環境 全過程及所需試劑要求無菌環境 全過程及所需試劑要求無菌環境。。。。 剪碎法：：：：將組織塊放入平皿後，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不鏽鋼濾網

(另購)過濾到試管內(nei) ；離心沉澱 1500轉/分×3 min，再用細胞洗滌液清洗 3次，每次以 500rpm短時低速離心除去細胞碎片，以 200 目不鏽鋼濾網（另購）過濾去細胞團塊。作細胞計數並調整細胞濃度為(wei) （2～5）×107個(ge) /ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為(wei) 2×108-1×109個(ge) /ml 的單細胞懸液備用。

勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nei) ，加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法胎牛血清；緩慢轉動研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清衝(chong) 洗研器；收集細胞懸液，經 200 目不鏽鋼濾網（另購）過濾；離心沉澱 800rpm×2min ，再用細胞洗滌液洗 3 次，離心沉澱。作細胞計數並調整細胞濃度為(wei) （2～5）×107個(ge) /ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為(wei) 2×108-1×109 個(ge) /ml 的單細胞懸液備用。 細胞計數方法: 細胞計數法是用來計數細胞懸液中細胞數量的一種方法。一般利用計數板（血球計數板）進行。既可用於(yu) 分離（散）細胞培養(yang) 接種前計數所製備的細胞懸液中的細胞數量，也可用於(yu)

對培養(yang) 物的細胞數量進行計數。不論計數的對象如何，均須製備分散的細胞懸液。

1）、在細胞計數板中央放置計數的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(ce) 的計數板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體(ti) 充滿為(wei) 止。

3）、置顯微鏡下計數四角大方格內(nei) 的細胞總數。對於(yu) 壓線的細胞隻計數在上線和左線者，

對於(yu) 細胞團按單個(ge) 細胞計數。

4）、按下式計數細胞懸液的密度：

細胞密度＝（4 個(ge) 大格細胞總數/4）×104個(ge) /ml×稀釋倍數

公式中乘以 104因為(wei) 計數板中每一個(ge) 大格的體(ti) 積為(wei) ：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

細胞計數要點：：：：

A． 進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低於(yu) 104個(ge) /ml，如果細胞數目很少要進行離

心再懸浮於(yu) 少量培養(yang) 液中；顯微鏡下計數時，遇到 2 個(ge) 以上細胞組成的細胞團，應按單個(ge) 細胞計算。如果細胞團>10％，說明細胞分散不充分; 或細胞數<200 個(ge) /10mm2或>500 個(ge) /10 mm2 時，說明稀釋不當，需重新製備細胞懸液。

B． 要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

C． 取樣前充分混勻細胞懸液，尤其多次取樣更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；

D． 數細胞的原則是隻數完整的細胞，若細胞聚集成團時，隻按照一個(ge) 細胞計算。如果細

胞壓在格線上時，則隻計上線，不計下線，隻計左線，不計右線。

E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。

初學者易犯的錯誤： 初學者易犯的錯誤：：：

A． 計數前未將待測懸液吹打均勻。

B． 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。

C． 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

三、、、、注意事項

A． 本分離液是敏光型的，運輸和貯藏過程中在 18℃-25℃避光保存，啟封後 4℃保存本品隻能用於(yu) 科學研究，不能用於(yu) 臨(lin) 床檢測

避免微生物汙染。本品為(wei) 真空包裝，未啟封前於(yu) 10℃ 以下易出現白色結晶，影響分離效果。

B． 待分離的血液及組織樣本要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一定在

20℃水浴箱中複溫 20 分鍾保證分離液和所分離樣本溫度在 20℃±2℃時分離效果，且

所有操作過程一定要在無菌條件下進行。

C． 由於(yu) 各品牌離心機的性能不同，國內(nei) 南北地區溫度環境和四季差異，可能影響分離

效果，用戶可調節離心轉數及離心時間，摸索*的分離條件（具體(ti) 分離條件各實驗室自定）。

D． 使用無靜電反應的離心管，推薦使用未經過堿處理的玻璃離心管。

E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。注意在血液稀釋過程中應去除抗凝劑體(ti) 積。

F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙一基澱粉 550、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液及

紅細胞裂解液等以我公司產(chan) 品為(wei) *選擇，本公司相關(guan) 係列產(chan) 品無菌、無病毒、無支原體(ti) 、

低內(nei) 毒素水平且無細胞毒性，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態。

四、、、、 產(chan) 品性能指標

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nei) 毒素 ≤0.5...EU/ml

無菌 直接接種培養(yang) 14 天後培養(yang) 基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

五、、、、 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期兩(liang) 年。啟封後置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保證無微生物汙染，啟封後可置 4℃長期保存。但應注意保存溫度較低時本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。