酶聯免疫測定（ELISA）標準化中存在的問題

免疫測定標準化的難點在於(yu) 蛋白的不均一性、基質效應、交叉反應以及需要測定接近測定方法下限的濃度等，所測定的免疫反應性通常是在糖基化、降解和複合形式上有差異的蛋白同種型的混合體(ti) 。

（一）基質效應

免疫測定的基質效應通常定義(yi) 為(wei) 幹擾抗原和抗體(ti) 間反應但與(yu) 分析物本身無關(guan) 的非特異

因素。基質效應與(yu) 測定模式和抗體(ti) 選擇有較大關(guan) 係，因此，其對不同免疫測定的影響方式也有所不同。基質效應通常由蛋白、鹽、磷脂、補體(ti) 、抗免疫球蛋白抗體(ti) （類風濕因子和人抗鼠抗體(ti) ）、藥物和可能汙染樣本的物質引起。這些效應可通過仔細的實驗設計來減少，例如使用一定亞(ya) 型的高親(qin) 和力抗體(ti) 或抗體(ti) 片段、降低樣本對總測定體(ti) 積的比例、在測定緩衝(chong) 液中加入免疫球蛋白、理想的溫育溫度和較長的溫育時間。免疫測定的校準物通常用類似於(yu) 樣本的基質的緩衝(chong) 液製備，基質可為(wei) 無分析物的人血清、無免疫學交叉反應抗原的動物血清或蛋白含量類似於(yu) 樣本的人工緩衝(chong) 液等。因為(wei) 血清的成分各有不同，每批血清基質的差異有可能會(hui) 影響校準，因此以純蛋白溶液作為(wei) 基質較容易保持一致，但對於(yu) 結合至血清蛋白的激索來說，除了人血清外，其他基質不能使用。

血清和血漿中總蛋白和鹽的濃度相當穩定，但尿液中鹽濃度則變化較大，鹽濃度增加對抗原抗體(ti) 間反應起一個(ge) 抑製作用。如果樣本體(ti) 積小於(yu) 總反應體(ti) 積的10%~15%，則蛋白的影響不明顯，但有時為(wei) 提高測定的敏感性，常需一個(ge) 較大的樣本體(ti) 積。因此，要求參考方法具有低的測定下限，且樣本體(ti) 積對總反應體(ti) 積應小至足以排除大部分基質效應。

樣本中的免疫球蛋白可通過與(yu) 測定中所使用的特異抗體(ti) 發生反應而影響測定結果。如自身免疫病患者常有可與(yu) 抗體(ti) 反應的類風濕因子（RF）針對動物免疫球蛋白的嗜異性天然抗體(ti) 相當普遍，但一般情況下其濃度和親(qin) 和力較低。自身抗體(ti) 和嗜異性天然抗體(ti) 的存在通常會(hui) 引起假陽性反應。這些幹擾可通過加入足量的來自同一種係的免疫球蛋白而減小，也可在測定中使用抗體(ti) 的Fab或（F‘ab）2片段替代完整抗體(ti) 來減小幹擾，但如果樣本含有針對試劑抗體(ti) 的個(ge) 體(ti) 基因型（idiotype）抗體(ti) ，則這種方法無效。這種情況下隻有將免疫球蛋白從(cong) 樣本中去除或使用一個(ge) 依據另一個(ge) 抗體(ti) 的方法測定。

各種補體(ti) 成分均能與(yu) 抗體(ti) 反應，從(cong) 而幹擾試劑抗體(ti) 結合抗原及與(yu) 次級抗體(ti) 反應的能力，在雙夾心測定中可引起假陽性，在競爭(zheng) 抑製試驗中引起假陽性。小鼠IgG2,和IgG2,免疫球蛋白亞(ya) 對補體(ti) 的效應尤為(wei) 敏感。可通過加熱樣本或在反應緩衝(chong) 液中加入螯合劑來排除補體(ti) 的幹擾，但加熱會(hui) 影響很多的分析物，而螯合劑對諸如鍺螯合劑和酶等非放射性核索標記物有幹擾，因此傾(qing) 向於(yu) 使用對補體(ti) 效應不敏感的抗體(ti) 或抗體(ti) 片段建立測定方法。

有報道稱磷脂在類固醇測定中可幹擾抗原的結合而引起結果的假增高，許多其他因子如血清分離膠中的成分、抗凝劑去垢劑、藥物、非酯化脂肪酸等對某些免疫測定也有幹擾。

（二）抗原的不均一性和交叉反應性

蛋白激索顯然是不均一的，其在血液循環中除了有生物學活性形式外，還有前激索、片段和亞(ya) 單位。富甲狀腺索（PTH）、ACTH及其前體(ti) 、催乳索和促胃液索的大的形式以及生長激索的拚接變異體(ti) 等均可引起測定問題。使用單克隆抗體(ti) 的兩(liang) 位點雙夾心測定大大改善測定的特異性，例如使用抗絨毛膜促性腺激索的。和P亞(ya) 單位的單抗建立的雙夾心方法將不會(hui) 測定遊離的亞(ya) 單位。使用針對ACTH或PTH的氨基和羧基末端部分的兩(liang) 個(ge) 抗體(ti) 建立的雙夾心方法則不會(hui) 測定無生物學活性的片段。一般情況下，所希望測定的是具有生物學活性的成分，但有時為(wei) 了某些特定的臨(lin) 床目的，則需要有特異的試驗來測定降解產(chan) 物，如hCG的核心成分。因此，為(wei) 保證測定的特異性，就不僅(jin) 要求有具有生物學活性的激索標準晶，而且要有臨(lin) 床上相關(guan) 的降解產(chan) 物的標準品。

某些血清蛋白有在等電點上不同（如。1―抗胰蛋白酶）或聚合程度不同（如觸珠蛋白）的各種遺傳(chuan) 變異體(ti) ，盡管這些變異體(ti) 的比例不同會(hui) 影響其免疫測定的結果，但這並不是血清蛋白免疫測定的突出問題。用於(yu) 血漿蛋白測定的試驗通常使用多克隆抗血清，多克隆抗體(ti) 測定不了蛋白結構上的微小差異。相反，使用單克隆抗體(ti) 則有可能測不到某些變異體(ti) ，這是血清蛋白免疫測定上的一個(ge) 普遍問題糖蛋白的不均一性主要在於(yu) 糖基化尤其是唾液酸含量的差異，唾液酸含量上的差異進而引起蛋白等電點和電泳移動性的差異。抗體(ti) 通常對這些差異不敏感，因此，糖的不均一性對免疫反應性影響很小。然而蛋白上的糖鏈可通過修飾或覆蓋一個(ge) 肽決(jue) 定基而改變蛋白的免疫反應性。相反，黏蛋白的主要抗原決(jue) 定基則由糖成分所組成。免疫測定實驗設計上小的差異也會(hui) 引起多態性抗原測定結果上較大的差異，黏蛋白抗原CA125,CA19―9和CA15―3的測定可以很明確的證明這一點。例如，由不同組織產(chan) 生的CA15―3含有不同數量的20個(ge) 氨基酸的串聯重複序列，而試驗中測定抗原所用的單抗是用腫瘤細胞製備的，因而所測定的抗原是結構不太明確的大分子。盡管大多數試劑廠家均使用相同的標準品和抗體(ti) ，但其相互之間的相關(guan) 性很差，這很可能是由於(yu) 在實驗設計上的差異所致，因此每一種方法都應有各自的參考範圍值。

（三）實驗設計

免疫測定的實驗設計主要涉及到抗體(ti) 或抗原的使用濃度、溫育溫度、溫育時間、測定模式是采用競爭(zheng) 抑製或雙夾心直接測定，以及雙夾心測定是采用一步還是兩(liang) 步法等，其對測定的影響主要是試驗的測定下限、特異性核簡便性等。一般來說，較高的抗體(ti) 或抗原反應濃度、較高的溫育溫度（如37~C而非室溫下）、較長的溫育時間可以改善免疫試驗的測定下限，但這一切又隻是相對的，還要從(cong) 試劑的實際應用著想，進行合理的優(you) 化。雙抗夾心酶免疫試劑由於(yu) 其簡單方便，又具有較好的測定下限和特異性，在大多數蛋白激索和腫瘤標誌物的測定上，現已基本上取代了放免競爭(zheng) 抑製試驗。雙抗夾心測定模式以兩(liang) 步法進行（即臨(lin) 床樣本與(yu) 酶標抗體(ti) 分兩(liang) 步加入），可避免許多用一步法時可能會(hui) 出現的問題，如與(yu) 標記抗體(ti) 可能發生交叉反應但與(yu) 固相捕獲抗體(ti) 無交叉反應的物質可在*步溫育後的洗滌步驟中去除；又如一步法常出現的“鉤狀”效應（即抗原濃度很高時反應顯色反而很淺，表現為(wei) 測假陽性）使用兩(liang) 步法就可以避免。但由於(yu) 兩(liang) 步法所需測定時間相對要長一些，因此目前在臨(lin) 床實驗中使用較多的是一步法。此外，當所測物質分子大小不一致時，大分子的反應通常較小分子要慢，如溫育時間短，也會(hui) 造成測定偏差。例如，在測定複合的前列腺特異抗原（PSA）（Mr90Kd）時，如使用較短的溫育時間，與(yu) 遊離PSA相比，其結果將偏低。

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