牛傳(chuan) 染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實時熒光PCR法）說明書(shu)

【產(chan) 品名稱】

通用名稱：牛傳(chuan) 染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實時熒光PCR法）

英文名稱：Contagious Bovine Pleuropneumonia (CBPP)Detecting Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】 25T/盒 ＆ 50T/盒

【預期用途】

本試劑盒利用改良分子信標實時熒光PCR原理，主要用於(yu) 牛傳(chuan) 染性胸膜肺炎的定性篩查檢測。

【檢驗原理】

本試劑盒針對牛傳(chuan) 染性胸膜肺炎基因設計特異性引物和探針，在反應體(ti) 係中含有牛傳(chuan) 染性胸膜肺炎 DNA模板的情況下，PCR反應得以進行並釋放熒光信號。利用儀(yi) 器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為(wei) 不含牛傳(chuan) 染性胸膜肺炎核酸的其它菌的混合物，陽性對照為(wei) 牛傳(chuan) 染性胸膜肺炎經滅活處理的核酸提取物。

【儲(chu) 存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反複凍融，有效期12個(ge) 月。

【適用儀(yi) 器】ABI 係列、Bio-Rad係列、Agilent Stratagene MX係列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene係列、等多通道實時熒光定量PCR儀(yi) 。

【樣本要求】

1. 動物組織樣本采集後取10mg～100mg用滅菌生理鹽500μL～1000μL水研磨，離心後取上懸液備用，避免標本間交叉汙染。

2. 標本收集後若不能立即檢測，可置於(yu) 2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存於(yu) -20℃～-80℃，長期保存不會(hui) 影響本試劑盒檢測結果，但有可能影響培養(yang) 法檢測結果的準確性。

3. 標本保存期間應避免反複凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區）

（1）從(cong) 冰箱中取出試劑盒, 從(cong) 試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻並瞬時離心以去除管壁附著液體(ti) 。

（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），並根據如下表所示反應體(ti) 係計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數

(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻後瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

(4) 蓋緊PCR反應管蓋後將PCR反應管和試劑盒中的DNA提取液轉移至樣本處理區。 剩餘(yu) 試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備（樣本處理區）

用本公司病毒核酸提取試劑盒提取DNA，具體(ti) 操作按照其試劑盒說明書(shu) 操作。或按以下方法操作：

a.取試劑準備區傳(chuan) 遞過來的DNA提取液，2000 rpm 離心10 s後備用。

b.取樣本自然沉降後的上清液1 mL，加入到1.5 mL無菌離心管中，12000 rpm離心5 min後，吸幹上清，保留沉澱。

c.每管沉澱中加入DNA提取液50 μL，將沉澱懸浮後100℃加熱處理5 min。

d.12000 rpm離心2 min，取上清用於(yu) PCR檢測。

3.加樣

在上述製備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體(ti) 積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻後瞬時低速離心，轉移到PCR儀(yi) 器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體(ti) 積為(wei) 25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻後瞬時低速離心，轉移到PCR儀(yi) 器上。

4.PCR（PCR擴增區）

（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀(yi) 樣品槽相應位置，並記錄放置順序。

（2）按下表設置儀(yi) 器核酸擴增相關(guan) 參數進行PCR擴增。

注：ABI係列熒光PCR儀(yi) 在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【陽性判斷值或者參考區間】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為(wei) 直線或輕微斜線，無指數增長期。

2.標本結果判定：

（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。

（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38範圍內(nei) 。此時應對標本進行重複檢測，如重複實驗結果Ct值仍在35～38範圍內(nei) ，有明顯指數增長期，則判定為(wei) 陽性，否則為(wei) 陰性。

（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

• 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低於本試劑盒的低檢出*可能會發生假陰性的結果。
• 本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對於本試劑盒檢測陽性結果應進一步使用培養法進行確診。

【產(chan) 品性能指標】 產(chan) 品的低檢出限為(wei) 10²CFU，產(chan) 品CV值≤5%。

【注意事項】

• 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作，各區實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全櫃，樣本處理在生物安全櫃中進行操作；三個區應該配有紫外線殺菌裝置。
• 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
• 為保證試劑不受標本汙染，必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應液保存於試劑準備區。
• 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，並應瞬時離心。
• 試劑盒內所配陰性和陽性對照在di一次使用前應全部轉移至標本準備區，並單獨存放。
• 為防止熒光幹擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，並應避免在PCR反應管上進行任何標記。
• 儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
• ABI係列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
• 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理後方可丟棄。