ELISA原理（實驗條件、技術要點）

實驗條件和技術要點：

酶聯免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,簡稱ELISA）與(yu) 免疫酶測定等名稱所指的內(nei) 容是不相同的，ELISA的內(nei) 容專(zhuan) 指固相吸附技術和免疫酶標抗體(ti) （或抗原）技術相結合的一種方法，它是將抗原或抗體(ti) 包被在固相支持物（或稱載體(ti) 上），然後再進行免疫反應，形成酶標記的抗原抗體(ti) 複合物，反應完畢，借助底物顯示特異結合的標記抗體(ti) （或抗原）上的酶活性，用酶與(yu) 底物反應後生成的有色產(chan) 物進行光密度測定，達到抗原或抗體(ti) 定量的目的。

在應用ELISA時，首先要清楚下麵內(nei) 容：1，是檢測抗體(ti) 還是抗原？2，檢測的結果是定性還是定量？3，是否需要檢測特異抗體(ti) 的類型？4，所用抗體(ti) /單克隆抗體(ti) 的親(qin) 和力怎樣？

(1)檢測抗原  zui常用於(yu) 檢測抗原的方法是非競爭(zheng) 性的雙抗體(ti) 夾心法，其次是競爭(zheng) 法。但競爭(zheng) 法在具體(ti) 實驗中有些困難，特別是檢測微生物的抗原，因為(wei) 需要標記抗原，這對於(yu) 某些抗原是很難做到的，甚至是不可能的。另外在競爭(zheng) 法中，酶標記的抗原與(yu) 標本直接混合在一起，許多標本中含有酶抑製劑或蛋白A樣物質，可影響ELISA的結果。

(2)檢測抗體(ti)   檢測抗體(ti) 種類常用的方法是檢測抗體(ti) 種類的捕獲法，這個(ge) 方法常用於(yu) 檢測特異性IgG、IgA和IgM.。這個(ge) 方法的*步是捕獲所需要檢測的一個(ge) 種類的抗體(ti) ，接下來是檢測捕獲的抗體(ti) 是否是特異性抗原的抗體(ti) 。間接ELISA在檢測IgG時比較簡單，但不適用於(yu) 檢測其他種類的抗體(ti) ，因為(wei) 血清中如果有特異IgG存在將與(yu) IgM或IgA等競爭(zheng) 結合抗原。

競爭(zheng) 法檢測抗體(ti) 有兩(liang) 種方法：一種是將標記的抗體(ti) 和標本同時加入反應孔內(nei) ，但標記的抗體(ti) 和標本中的抗體(ti) 必須是結合抗原的不同決(jue) 定簇；另一種是先加標本，衝(chong) 洗後再加標記的抗體(ti) 。競爭(zheng) 法檢測抗體(ti) 比間接法容易判斷結果，並且比較敏感和特異。不論選擇哪種方法，ELISA都包括6個(ge) 步驟：1，抗原或抗體(ti) 吸附於(yu) 固相；2.加標本和試劑；3，孵育和衝(chong) 洗；4，加酶標抗原或抗體(ti) ；5，加適當的底物；6，檢測和分析結果。

雖然ELISA法在理論上十分簡單，但每一步都有要注意的事項。不論是新設計的ELISA還是沿用其他ELISA方法都有以下幾方麵技術要點：固相載體(ti) 的選擇和試劑的製備，反應條件和操作的標準化。酶標記抗原競爭(zheng) 法利用混合的未標記抗原和酶標記抗原相互競爭(zheng) 抗體(ti) 上的結合點，從(cong) 而進行抗原的定量。未標記抗原的量越大，則酶標記抗原和抗體(ti) 的結合就越受到抑製。但是競爭(zheng) 法在實驗時比較複雜，有時在抗原混合液與(yu) 相應抗體(ti) 孵育後，在測定遊離抗原與(yu) 抗體(ti) 相結合抗原的活性以前，要先進行鹽析或有機溶劑沉澱或第二抗體(ti) 沉澱等方法把兩(liang) 種不同存在形態的抗原分開。並且在加入底物後，容易產(chan) 生血清色的物質。因此，每次測定時都需做空白對照。由於(yu) 這些缺點，酶標記抗原競爭(zheng) 法使用不多。

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