pUC-T TA快速連接試劑盒（含載體(ti) ，連接酶）說明書(shu)

pUC-T Quick Ligation Kit

pUC-T TA快速連接試劑盒（含載體(ti) ，連接酶）

目錄號：YJ2591

保存條件：-20℃保存。

組分說明

                Cat. No.                            YJ2591

                Size                                  20次

                pUC-T（50 ng/μl）                       20 μl

                Conctrol Insert (50 ng/μl)            10 μl

                Quick T4 DNA Ligase                   20 μl

                2×Quick Ligation Reaction Buffer     120 μl

              本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及其他用途  

產(chan) 品簡介

　　pUC-T TA載體(ti) 是一種克隆PCR產(chan) 物的載體(ti) ，它是由pUC18載體(ti) 在EcoR V

酶切位點處切開，在兩(liang) 側(ce) 的3′端添加T而成。由於(yu) 大部分耐熱聚合酶反應時都會(hui) 在 PCR

產(chan) 物的3′端添加一個(ge) A，它可以與(yu) pUC-T 3′端的T互補連接，因此可大大提高PCR產(chan) 物的連接和克隆效率。

　試劑盒中配備率的T4 DNA Ligase和為(wei) 快速DNA連接優(you) 化的2×Quick Ligation 

Reaction Buffer。連接效率相當於(yu) 用T4 DNA Ligase 進行常規連接1小時。帶有插入片

段的重組子可根據α互補原理，進行藍白斑篩選，判斷載體(ti) 中有無外源基因的插入。克

隆後可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物對PCR產(chan) 物進行測序。

注意事項

1．Insert DNA 要求

   1）連接使用的PCR片段3’末端應帶有“A"尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的  Pfu擴增的PCR產(chan) 物是平滑末端，可使用加A試劑盒加上A尾後，再進行T載體(ti) 克隆。

   2）PCR產(chan) 物建議進行切膠回收純化後再進行T載體(ti) 克隆，以免PCR產(chan) 物中的非特異片

   段或殘存引物等雜質影響。推薦使用  YJ2302/YJ0524/YJ0518 快速瓊脂糖凝膠

   DNA回收試劑盒。

2．連接反應要求

   1）本試劑盒能使大多數連接反應在25℃條件下5分鍾甚至更短時間內(nei) 達到反應終點，

   增加反應時間反應效率不會(hui) 增強。如用快速連接反應  1小時後，轉化效率會(hui) 明顯降

   低；如25℃快速連接反應過約夜，則轉化效率會(hui) 下降到75%。

   2）2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置於(yu) 冰上使其融化後充分混

   勻，建議初次使用分裝成小管凍存，避免其反複凍融影響DNA連接效率。

   3）由於(yu) T4 DNA Ligase中含有甘油，比較粘稠容易掛壁，建議使用之前短暫離心將

   液體(ti) 收集到管底，取樣時槍頭盡量不要深入液麵太深，以免粘在槍頭上造成損失。

   4）如快速連接產(chan) 物用於(yu) 電轉，因快速連接反應體(ti) 係中的PEG會(hui) 影響電轉效率，建議

   使用離心柱將連接產(chan) 物進行DNA純化（如YJ2301快速DNA產(chan) 物純化試劑盒）後再

   進行電轉。

3．感受態細胞要求

   建議使用的熱擊轉化感受態細胞，這樣才可能得到比較理想的陽性克隆，如需  

   進行藍白篩選，宿主細胞必須具有正確的基因型（F′編碼的【lacZ ΔM15】）產(chan) 生ω片

   段，才能與(yu) 載體(ti) DNA產(chan) 生的LacZ  α多肽結合，表現出β-半乳糖苷酶活性（α互補）。

   pUC-T  TA載體(ti) 以pUC18載體(ti) 為(wei) 基礎構建而成，因此，適合pUC18載體(ti) 的感受態細胞都可以使用。推薦使用本公司YJ0807 *0感受態細胞、YJ0808 DH5α感受態細胞。

4．陽性克隆篩選

   陽性DNA片段成功插入至pUC-T Vector中後，一般情況下β-半乳糖苷酶的表達將受

   到破壞，重組克隆體(ti) 在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固體(ti) 培養(yang) 基上培養(yang) 時將顯示白 

   色菌落。但有時比較短的DNA片段插入載體(ti) 時，基因的讀碼框有可能正好與(yu) LacZ的 

   讀碼框相吻合，克隆體(ti) 也會(hui) 顯示藍色菌落。

5．陽性對照

   為(wei) 了確認實驗操作的正確性，以及實驗試劑的有效性，我們(men) 建議使用本試劑盒中配

   備的Control Insert（750 bp）進行陽性對照實驗。

使用方法

1．按以下體(ti) 係配製反應液：

             成分                              反應體(ti) 係          對照體(ti) 係

             pUC-T                             1 μl          1 μl

             DNA插入片段   *                   0.1 -0.3 pmol      --

             Control Insert DNA                 --           1 μl

             2×Quick Ligation Reaction  Buffer 5 μl          5 μl

             Quick T4 DNA Ligase               1 μl          1 μl

             RNase-Free Water               補足至 10 μl     補足至 10 μl

     *Insert DNA的使用量：在進行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為(wei) ：1:2-1:10，

     可根據實驗情況選擇適當的Vector DNA和Insert DNA的摩爾數比。Insert DNA的使用量=nmol數×660×Insert DNA bp數。本載體(ti) 1 ml（50  ng）的摩爾數約為(wei) 0.03 pmol。

2．輕輕混合，短暫離心。25℃反應5分鍾。

   注意：反應時間不要超過15分鍾，否則會(hui) 降低連接效率。

3．反應結束後，將DNA連接產(chan) 物存放於(yu) 0-4℃，而後進行轉化實驗；也可將  DNA連接

   產(chan) 物置於(yu) -20℃保存。

   注意：勿進行加熱失活反應。

4．將連接產(chan) 物加入50 μl感受態細胞中（將感受態細胞置於(yu) 冰上融化），冰浴30分鍾。

   注意：用化學法轉化時，連接產(chan) 物的加入量不要超過感受態細胞體(ti) 積的10%。

5．42℃熱擊45秒鍾，迅速將離心管轉移到冰浴中，冰上靜置2-3分鍾。

6．加入450 μl無菌SOC或LB培養(yang) 基，混勻後置於(yu) 37℃搖床，150 rpm振蕩培養(yang) 45分鍾，

   使菌體(ti) 複蘇。

7．根據實驗要求，取適量已轉化的感受態細胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固體(ti)

   培養(yang) 基上，用無菌的塗布棒將細胞均勻塗開，將平板置於(yu) 37℃，直至液體(ti) 被吸收後，

   倒置培養(yang) ，37℃培養(yang) 12-16小時。

8．計算白、藍色菌落，挑選白色菌落，使用PCR法或酶切法鑒定插入片段是否正確。