大鼠抑製素A（INHA）ELISA試劑盒說明書(shu)
本試劑僅(jin) 供研究使用       目的：本試劑盒用於(yu) 測定大鼠血清，血漿及相關(guan) 液體(ti) 樣本中抑製素A（INHA）的含量。
抑製素A實驗原理：
  本試劑盒應用雙抗體(ti) 夾心法測定標本中大鼠抑製素A（INHA）水平。用純化的大鼠抑製素A（INHA）抗體(ti) 包被微孔板，製成固相抗體(ti) ，往包被單抗的微孔中依次加入抑製素A（INHA），再與(yu) HRP標記的抑製素A（INHA）抗體(ti) 結合，形成抗體(ti) -抗原-酶標抗體(ti) 複合物，經過*洗滌後加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的抑製素A（INHA）呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠抑製素A（INHA）濃度。
抑製素A試劑盒組成：
 
試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存   
說明書(shu)  1份 1份    
封板膜 2片（48） 2片（96）    
密封袋 1個(ge)  1個(ge)     
酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存   
標準品：225ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存   
標準品稀釋液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存   
酶標試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存   
濃縮洗滌液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存

樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鍾，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為(wei) 抗凝劑，混合10-20分鍾後，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yang) 上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nei) 的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬(wan) /ml左右。通過反複凍融，以使細胞破壞並放出細胞內(nei) 成份。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測，其餘(yu) 冷凍備用。
6. 標本采集後盡早進行提取，提取按相關(guan) 文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於(yu) -20℃保存，但應避免反複凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑製辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標2. 準品的稀釋與(yu) 加樣：在酶標3. 包被板上設標4. 準品孔10孔，5. 在*、第二孔中分別加標6. 準品100μl，7. 然後在*、第二孔中加標8. 準品稀釋液50μl，9. 混勻；然後從(cong) *孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，10. 再在第三、第四孔分別加標11. 準品稀釋液50μl，12. 混勻；然後在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，13. 再各取50μl分別加到第五、第六孔中，14. 再在第五、第六孔中分別加標15. 準品稀釋液50ul，16. 混勻；混勻後從(cong) 第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，17. 再在第七、第八孔中分別加標18. 準品稀釋液50μl，19. 混勻後從(cong) 第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，20. 再在第九第十孔分別加標21. 準品稀釋液50μl，22. 混勻後從(cong) 第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋後各孔加樣量都為(wei) 50μl，23. 濃度分別為(wei) 150ng/L，24. 100ng/L ，25. 50ng/L，26. 25ng/L，27.  12.5ng/L）。
28. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不29. 加樣品及酶標30. 試劑，31. 其餘(yu) 各步操作相同32. ）、待測樣品孔。在酶標33. 包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液50μl，34. 然後再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為(wei) 5倍35. ）。加樣將樣品加於(yu) 酶標36. 板孔底部，37. 盡量不38. 觸及孔壁，39. 輕輕晃動混勻。
40. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾。
41. 配液：將30（48T的20倍42. ）倍43. 濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍44. ）倍45. 稀釋後備46. 用。
47. 洗滌：小心揭掉封板膜，48. 棄去液體(ti) ，49. 甩幹，50. 每孔加滿洗滌液，51. 靜置30秒後棄去，52. 如此重複53. 5次，54. 拍幹。
55. 加酶：每孔加入酶標56. 試劑50μl，57. 空白孔除外。
58. 溫育：操作同59. 3。
60. 洗滌：操作同61. 5。
62. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，63. 再加入顯色劑B50μl，64. 輕輕震65. 蕩混勻，66. 37℃避光顯色15分鍾.
67. 終止：每孔加終止液50μl，68. 終止反應（此時藍色立轉黃色）。
69. 測定：以空白空調零，70. 450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鍾以內(nei) 進行。
注意事項：
1． 試劑盒從(cong) 冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用，2． 酶標3． 包被板開封後如未用完，4． 板條應裝入密封袋中保存。
5． 濃洗滌液可能會(hui) 有結晶析出，6． 稀釋時可在水浴中加溫助溶，7． 洗滌時不8． 影響結果。
9． 各步加樣均應使用加樣器，10． 並經常校對其準確性，11． 以避免試驗誤差。一次加樣時間控製在5分鍾內(nei) ，12． 如標13． 本數量多，14． 推薦使用排槍加樣。
15． 請每次測定的同16． 時做標17． 準曲線，18． 做複19． 孔。如標20． 本中待測物質含量過高（樣本OD值大於(yu) 標21． 準品孔*孔的OD值），22． 請先用樣品稀釋液稀釋一定倍23． 數（n倍24． ）後再測定，25． 計算時請zui後乘以總稀釋倍26． 數（×n×5）。
27． 封板膜隻限一次性使用，28． 以避免交叉汙染。
29． 底物請避光保存。
30． 嚴(yan) 格按照說明書(shu) 的操作進行，31． 試驗結果判定必須以酶標32． 儀(yi) 讀數為(wei) 準.
33． 所有樣品，34． 洗滌液和各種廢棄物都應按傳(chuan) 染物處理。
35． 本試劑不同36． 批號組分不37． 得混用。
計算：
以標準物的濃度為(wei) 橫坐標，OD值為(wei) 縱坐標，   
在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD     
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋     
倍數；或用標準物的濃度與(yu) OD值計算出標     
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值     
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋     
倍數，即為(wei) 樣品的實際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與(yu) 預期濃度相關(guan) 係數R值為(wei) 0.990以上。
2.批內(nei) 與(yu) 批見應分別小於(yu) 9%和11%
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個(ge) 月
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