細胞培養(yang) 基本要點

（一）準備和安裝過濾器　（二）合成培養(yang) 基的配製　（三）小牛血清的處理　（四）生長培養(yang) 基的配製

（五）凍存細胞的複蘇　　（六）傳(chuan) 代　　　　　　　（七）凍存　　　　　　（八）注意事項

（一）準備和安裝過濾器

　　清洗好過濾器，幹燥，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進行高壓滅菌處理。 在超淨台內(nei) 打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體(ti) 中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過濾，過濾後要檢查濾膜是否完好無損。

（二）合成培養(yang) 基的配製

　　1、根據細胞目錄中的說明，按下表選擇合適品牌及貨號的培養(yang) 基幹粉，用適量超純水充分溶解。

培養(yang) 基  品牌  貨號  

D-MEM/F-12 GIBCO 12400024

Dulbecco's Modified Eagle Medium （D-MEM）, powder （high glucose） GIBCO 12800017

F-12 Nutrient Mixture （Ham） powder GIBCO 21700075

Iscove's Modified Dulbecco's Medium （IMDM） powder GIBCO 12200036

Leibovitz's L-15 Medium powder GIBCO 41300039

McCOY's  SIGMA M4892

Minimum Essential Medium （MEM） Alpha Medium powder （MEMα）

with ribonucleosides and deoxyribonucleosides GIBCO 11900024

Minimum Essential Medium （MEM） Alpha Medium powder （MEMα）

without ribonucleosides and deoxyribonucleosides GIBCO 12000022

Minimum Essential Medium （MEM） powder GIBCO 41500034

NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'S

MODIFICATION （F12K） SIGMA N3520

RPMI Medium 1640 GIBCO 31800022

EGF SIGMA E9644

Sodium pyruvate SIGMA P2256-25G

MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED SIGMA M5017

　　2、 按要求添加碳酸氫鈉、穀氨酸鈉、HEPES等，充分攪拌使之溶解。

　　3、 調 pH至7.2左右。

　　4、 加水至zui終體(ti) 積。

　　5、 在超淨台中對溶液進行濾過除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。

　　6、 瓶口封好，4℃冰箱貯存。

（三）小牛血清的處理

　　市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體(ti) （近來也有觀點認為(wei) 熱滅活處理是不必要的）。胎牛血清不必滅活。

　　1、 將血清加熱至56℃並保持30 min，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉澱析出。

　　2、 處理後的血清貯存於(yu) 4℃。

　　3、 小牛血清在使用前進行篩選以掌握血清的質量。

（四）生長培養(yang) 基的配製

　　除無血清培養(yang) 之外，各種合成培養(yang) 基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。

培養(yang) 基分裝成小瓶（100～200 mL）以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。

按如下比例配製： 基本培養(yang) 基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％體(ti) 積分數加入雙抗貯存液（青黴素+鏈黴素），使青黴素和鏈黴素的終濃度分別為(wei) 100 U／mL和100 μ／mL，。

（五）凍存細胞的複蘇

應遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調至37-37。5度，取出凍存的細胞迅速放入後將細胞麵浸至水麵以下不斷搖動至融化。

在無菌台內(nei) 將*培養(yang) 基加入50ml的小培養(yang) 瓶內(nei) ，約5ml左右，然後用無菌吸管從(cong) 凍存管內(nei) 取出細胞，置培養(yang) 並內(nei) 輕輕搖晃，使細胞均勻後置培養(yang) 箱內(nei) 培養(yang) 。

（六）傳(chuan) 代:

貼壁細胞:

對於(yu) 貼壁細胞應先吸（倒）盡培養(yang) 基，吸的越幹淨越好，以免中和後加入的消化液，使強度減弱（或PBS洗1－3次）。50ml培養(yang) 瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進行消化，（根據經驗），晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yang) 箱約2-5分鍾，鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落後，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml*培養(yang) 基後，輕輕吹打，使細胞基本成單個(ge) 懸浮，然後分置其它無菌培養(yang) 瓶內(nei) ，加入*培養(yang) 基後繼續培養(yang) 或實驗。

懸浮細胞:

一般傳(chuan) 代可直接將細胞原液分置其它培養(yang) 瓶內(nei) ，加入*培養(yang) 基繼續培養(yang) ，如要高濃度可先離心1000rpm，5min後加入*培養(yang) 基，輕輕吹勻後，分置其它培養(yang) 瓶內(nei) 加入*培養(yang) 基繼續培養(yang) 。

（七）凍存

　　 將貼壁細胞消化後離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以*培養(yang) 基或胎牛血清重懸細胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。

（八）注意事項

玻璃吸管和玻璃培養(yang) 瓶的消毒:1）高壓蒸汽滅菌15分鍾以上;2）幹烤消毒140度2小時以上;

無菌工作台先清洗後用75%酒精擦拭幹淨，紫外線照射40分鍾以上;各種培養(yang) 板照射3小時以上;

培養(yang) 基（pH7.2）和血清配製好後要做無菌試驗:將血清按10%加入培養(yang) 基內(nei) ，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yang) 基5-10ml置培養(yang) 箱內(nei) 培養(yang) 2-3天，肉眼見無渾濁或沉澱等異物。分裝後置4度保存;

消化液（pH7.8）或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存;

培養(yang) 箱應先用清水清洗後用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應照射1小時以上，如有高溫滅菌的應按程序來菌）。至少每月一次。

進入操作時應注意先清洗雙手及手腕，然後用75%酒精擦拭，操作時注意無菌台內(nei) 空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數量較多，培養(yang) 瓶應放在與(yu) 酒精燈平行地方便於(yu) 操作，瓶與(yu) 瓶之間應相隔一定的距離，開瓶（蓋）時應先用75%酒精反複擦拭或用燈燒，打開後應用燈先燒口，然後燒蓋。用完後同樣操作。整個(ge) 操作過程盡量在無菌台靠裏麵一點。