CY3標記

CY3標記反應原理：
Reactive CY3專(zhuan) 一的與(yu) 伯胺反應（N-末端及賴氨酸殘基側(ce) 鏈）形成穩定的酰胺鍵

操作過程：
實驗前準備：

1.   仔細閱讀使用說明書(shu) 。

2.   計算待使用Reactive CY3的量。

3.   提前20 min從(cong) 冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫（注：不需要用到的Reactive CY3繼續放置冰箱中）。

4.   溶解Reactive CY3：加入20 μL DMF至Reactive CY3瓶中，靜置10 min，待其充分溶解，此時CY3的濃度為(wei) 10 mM。

 
操作步驟：（本操作步驟按照1 mg的量進行標記）

1.   取1 mg待標記抗體(ti) 於(yu) Filtration tube中，並加入相應體(ti) 積的 Labeling Buffer至總體(ti) 積為(wei) 0.5 mL，12,000× g離心10 min。（注：①Filtration tube的最大體(ti) 積為(wei) 0.5 mL。②待標記抗體(ti) 濃度低時，可先超濾離心一次。）

2.   加入13.3 μL Reactive CY3 和適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使抗體(ti) 的終濃度為(wei) 2 mg/mL，並輕輕吹打混勻。放入37℃恒溫箱中避光溫育60 min。

3.   12,000 × g離心10 min。

4.   加入適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使終體(ti) 積為(wei) 0.5 mL，並輕輕吹打混勻，12,000×g離心10 min。並重複操作一次。

5.   加0.2 mL Labeling Buffer至Filtration tube中，輕輕吹打。將濾芯倒轉放置於(yu) 另一個(ge) 離心管中，6,000×g離心10 min。

6.   收集離心管中的溶液，即為(wei) CY3標記的抗體(ti) 。

 
注意事項：

1.   本試劑盒也可標記其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具體(ti) 標記比例根據待標記物中氨基的數量確定。

2.   DMF要密封幹燥保存，使用完立即用封口膜封緊。

3.   操作步驟5中，可用Labeling Buffer作為(wei) 回收標記抗體(ti) 的緩衝(chong) 液，也可使用其它任何緩衝(chong) 液或保護劑。

4.   本試劑盒未開封前的有效期為(wei) 一年，請在有效期內(nei) 使用。

5.   本試劑盒提供的為(wei) 10 kDa的Filtration tube，標記抗原或多肽請注意分子量的大小。

6.   在步驟2中，標記其它抗體(ti) 時，我們(men) 應先控製抗體(ti) 的終濃度為(wei) 2 mg/mL，然後再根據抗體(ti) 的量計算應加入Reactive CY3的體(ti) 積。

7.   要確定在偶聯中不引入遊離氨基（Tris，氨及疊氮鈉均可與(yu) 活化CY3反應，因此會(hui) 降低蛋白與(yu) CY3的偶聯率）。

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