流式細胞術實驗操作步驟

流式細胞技術（Flow cytometry, FCM）是利用流式細胞儀(yi) 進行的一種單細胞定量分析和分選技術。流式細胞術是單克隆抗體(ti) 及免疫細胞化學技術、激光和電子計算機科學等高度發展及綜合利用的高技術產(chan) 物，它能有效地從(cong) 單細胞水平區分異質性細胞群體(ti) ，檢測對象包括但不限於(yu) 懸浮細胞、貼壁細胞或從(cong) 實體(ti) 組織分離的單細胞懸液和其他生物顆粒。

一、細胞表麵染色步驟

1.細胞準備：

1.1 采集全血或組織（脾，淋巴結，胸腺和骨髓等），用細胞染色buffer（或PBS）製成單細胞懸液。對於(yu) 體(ti) 外刺激的細胞，直接將刺激後的細胞懸浮在細胞染色buffer（或PBS）中，然後進行第2步。

1.2 加滿細胞染色buffer（或PBS）, 1000 rpm 離心細胞懸液5分鍾，棄掉上清。

2. 紅細胞裂解：

2.1 如果需要裂解紅細胞（如脾髒），將10×紅細胞裂解液（RBC）用H2O稀釋到1×，放置到室溫。將細胞重懸於(yu) 3 mL 1 × RBC中，室溫孵育5分鍾。

2.2 加入10 mL細胞染色buffer（或PBS）終止紅細胞裂解，1000 rpm離心細胞懸液5分鍾，棄掉上清。

2.3 重複洗滌一次，同步驟1.2。

2.4 細胞計數，用細胞染色buffer（或PBS）將細胞製成1×107 /mL懸液。將100 μL細胞懸液加入流式管中備用。

3. 封閉Fc受體(ti) ：

        封閉Fc受體(ti) 能減少染色過程中的非特異性染色。小鼠中，純化的CD16/CD32單抗能和FcγRⅢ/Ⅱ結合，封閉非特異性染色，可加入5-10 μg/mL的Anti-Mouse CD16/32單抗100 μL，冰上孵育10分鍾。對於(yu) 人和大鼠，可直接使用過量的與(yu) 熒光抗體(ti) 相同來源和亞(ya) 型不相關(guan) 的純化Ig或者血清進行阻斷。

4. 細胞染色：

4.1 按照說明書(shu) 的推薦用量加入熒光標記的抗體(ti) ，混勻後置於(yu) 冰上，避光孵育30分鍾。

4.2 加入5 mL FACs buffer (或PBS) 重懸細胞，1000 rpm離心細胞懸液5分鍾，棄掉上清。

4.3 加入0.5 mL FACs buffer(或PBS)重懸細胞，用流式細胞儀(yi) 進行檢測和分析。

注意事項

1. 在抗體(ti) 使用之前，快速離心一下，使之聚集到管的底部。

2. 熒光標記的抗體(ti) 應該避光4℃保存，不要冷凍。

3. 當染色的時候，固定或延遲分析可能降低某些抗體(ti) 的熒光信號。為(wei) 了得到更好的結果，染色後應該馬上分析。

二、細胞內(nei) 細胞因子染色步驟

1. 細胞準備：

1.1 收集細胞，用細胞染色buffer（或PBS）製成單細胞懸液，調整細胞濃度約為(wei) 1 × 107/mL。

1.2  如需裂解紅細胞，將紅細胞裂解液(RBC)稀釋至1×，並平衡至室溫，用適量的1×紅細胞裂解液將細胞懸起，室溫避光孵育10分鍾；加入細胞染色buffer（或PBS）終止裂解，1000 rpm離心5分鍾，棄去上清。加入細胞染色buffer（或PBS）重複洗滌一次，調整細胞濃度約為(wei) 1 × 107/mL。

1.3 取100 μL細胞/管（約1 × 106細胞），分別加到已經標記好的流式管底部。

2. 固定：

2.1 如需要表麵染色，則依照“細胞表麵染色步驟"選用適宜抗體(ti) 進行表麵染色。然後用稀釋至1×的細胞固定/破膜液（Fixation/Permeabilization buffer），將流式管中的細胞懸起，室溫避光孵育30分鍾。

2.2 1000 rpm離心5分鍾，棄去上清。

3. 破膜：

3.1 用稀釋至1×細胞破膜buffer將固定過的細胞懸起，1000 rpm離心力離心5分鍾，棄去上清。

3.2 重複洗一次，1000 rpm離心5分鍾，棄去上清。

3.3 加入1 mL 1×細胞破膜buffer，4℃避光孵育30分鍾；1000 rpm離心5分鍾，棄去上清。

4. 胞內(nei) 染色：

4.1 用100 μL 1×細胞破膜buffer重懸細胞，加入相應的抗體(ti) ，混勻，4℃避光孵育至少30分鍾。

4.2 加入2 mL 1×細胞破膜buffer懸起細胞，1000 rpm離心5分鍾，棄去上清。

4.3 加入2 mL細胞染色buffer（或PBS）懸起細胞，1000 rpm離心5分鍾，棄去上清。

4.4 加入0.5 mL細胞染色buffer（或PBS）重懸細胞，用流式細胞儀(yi) 進行檢測和分析。

注意事項

1. 同一個(ge) 細胞同時做細胞表麵和細胞內(nei) 的蛋白，建議先做細胞表麵染色，再固定、破膜。

2. 細胞內(nei) 染色推薦使用同型對照。

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