Western blot 實驗注意事項

1. 配膠時，建議先加水， 再加Tris-HCL緩衝(chong) 液，並且每加一種液體(ti) 就混勻膠液。加入的TEMED有毒，務必在通風櫥中操作， 並且加入後立即混勻、灌膠。丙烯酰胺未聚合的單體(ti) 有神經毒性， 能夠經皮膚吸收， 需戴手套操作。

2. AP作為(wei) 催化劑能夠提供氧自由基促使丙烯酰胺單體(ti) 聚合， TEMED作為(wei) 加速劑能夠促進AP釋放氧自由基，加速丙烯酰胺單體(ti) 的聚合。空氣溫度較低時稍稍多加TEMED可加快膠的凝固速度，但要確保AP未變質，否則無效。

3. AP應現配現用， 否則變質會(hui) 導致膠不聚合。另外， TEMED添加過量會(hui) 使膠凝得過快並且孔徑大小不一，影響蛋白的電泳，甚至可能燒膠。

4. 電泳內(nei) 槽中應加入新鮮的電泳液， 並且應先拔梳子再安裝入電泳槽， 添加電泳液。這樣能夠衝(chong) 洗掉各孔中碎膠， 確保電泳時條帶平直。

5. 建議兩(liang) 邊加入預染的Protein Marker，方便觀察不同KDa蛋白的分離情況，也方便後續的裁膜。

6. 電轉液中一般需加入甲醇或乙醇， 而電轉時的放熱會(hui) 加速醇類的揮發進而影響下一次重複使用時的電轉效果。重複使用電轉液時應考慮到醇類的揮發而適當延長電轉時間， 最好是每次電轉時都使用新的電轉液。不同KDa的蛋白電轉的條件不同， 所以可以針對目的蛋白進行切膠， 然後在不同條件下電轉。

7. 蓋上PVDF膜後， 不要再輕易移動， 否則條帶會(hui) 模糊。兩(liang) 邊的濾紙不能相互接觸，接觸後會(hui) 發生短路，蛋白會(hui) 轉不過來。

8. 封閉常用脫脂奶粉或BSA，建議建議做磷酸化蛋白的western時使用BSA（牛血清蛋白） 作為(wei) 封閉液。奶粉含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出現背景深的現象。並且脫脂奶粉含磷酸酶， 磷酸酶與(yu) 膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化， 用磷酸化特異性抗體(ti) 分析磷酸化蛋白時會(hui) 受到影響。

9. 一抗在四度孵育時能夠延緩抗體(ti) 的衰減速度， 提高重複利用的次數。建議嚴(yan) 格按照要求進行洗膜， 不要輕易減少洗膜的次數和時間。Tween20作為(wei) 一種非離子表麵活性劑， 能夠減少非特異性的抗體(ti) 結合， 降低背景。所以如果曝光後發現背景高，可以將1XPBST/TBST中Tween20從(cong) 0.05%提高到0.5%，並且增加洗膜次數。

10. 曝光時盡量將目標蛋白和內(nei) 參一起曝光， 便於(yu) 比較。如果使用傳(chuan) 統的壓片曝光， 可以壓兩(liang) 張甚至更多的片子並折角， 折角可以確定方向， 增加壓片數量可以控製曝光強度。離膜最近的片子記錄亮度低的蛋白條帶的情況， 離膜遠的蛋白可以保證亮度強的蛋白不過曝。

11. 曝光時多使用ECL發光試劑盒， 注意含量稀少的磷酸化蛋白等可以使用超敏型試劑以增加亮度， 而內(nei) 參等含量較多的蛋白則應使用普通的ECL發光試劑防止過亮，阻礙曝光。

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