細胞凍存

細胞生物學研究中，為(wei) 了更好而長期地研究細胞生物學功能，需要將良好狀態的細胞保存起來，以備將來使用。

在不附加任何保護劑下直接凍存細胞時，細胞內(nei) 和外環境中的水都會(hui) 形成冰晶，能導致細胞內(nei) 發生機械損傷(shang) 、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yang) 液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內(nei) 水份在凍結前透出細胞。貯存在負 130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細胞凍存時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，待複蘇時重新進入生長分裂周期。

一、實驗前準備

實驗開始前，將凍存管、15 毫升離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超淨工作台，以紫外線照射 30 分鍾。采用通風機通風 3 分鍾。以 75%酒精擦拭操作台和雙手。準備好冰盒。

將離心機調節至 800 轉，5 分鍾。水浴箱調節至 37 度恒溫。取細胞完全培養(yang) 基、DMSO、胰蛋白酶等，放於(yu) 水浴箱中預熱。

首先消毒雙手和超淨台。取約 10 毫升細胞完全培養(yang) 基放於(yu) 15 毫升離心管中。

配置細胞凍存液：凍存液應該提前配製，置於(yu) 室溫備用，防止臨(lin) 時配製產(chan) 生的熱量損傷(shang) 細胞，按無血清培養(yang) 基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置細胞凍存液，其中加大凍存液中血清的比例對於(yu) 保存某些脆弱的幹細胞以及一些比較珍貴的細胞很有好處的。

按比例加好凍存液組分後，輕輕吸打混勻，置於(yu) 室溫下待用。

二、胰蛋白酶/EDTA 消化

從(cong) 細胞培養(yang) 箱中取出細胞，進行瓶口消毒，棄去細胞原來的培養(yang) 基。按每 25 平方厘米1 毫升胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細胞變圓後立即拿入超淨台內(nei) ，加入兩(liang) 毫升細胞完全培養(yang) 基以立即終止消化。

采用無菌槍頭輕輕吹打細胞表麵，注意吹打全部培養(yang) 表麵，可以按照先左右吹打，後上下吹打的方式，取所有細胞懸液放入一幹淨的 15 毫升離心管內(nei) 。

配平離心：采用天平配平兩(liang) 端，每分鍾 800 轉，室溫離心 5 分鍾。

三、細胞計數

采用羅氏 CASY-DT 快速細胞計數及活率分析儀(yi) 進行細胞計數。加入 10 毫升 CASY-ton至以標記 viable 的管子中，加入 100 微升細胞懸液，顛倒混勻三次，可進行細胞計數。可見每毫升懸液中有活細胞總數。

四、細胞凍存

取出凍存管，注明細胞名稱、代數、日期。

離心後，以無菌吸管吸棄上清液，不要吸到底部的細胞沉澱。將細胞沉澱與(yu) 凍存液充分混勻，根據計數結果，將細胞總數調節至細胞數量為(wei) 每毫升有 5 乘 10 的五次方為(wei) 宜。

將細胞凍存懸液分裝入細胞凍存管中，一般一個(ge) 兩(liang) 毫升凍存管裝入 1 至 1.5 毫升細胞凍

存懸液為(wei) 宜。

嚴(yan) 密封口後，進行程序性降溫凍存：

首先 4 度 30 分鍾，負 20 度 30 分鍾，負 80 度過夜，最後進行液氮保存。

另有一種比較實用的降溫方法：用最少兩(liang) 厘米厚的醫用棉紗將凍存管緊緊包裹，紮緊，直接放入-70 度冰箱，隔夜取出凍存管直接放液氮凍存。或直接采用程序性降溫盒更為(wei) 方便。

五、注意事項

1、細胞活力及濃度

細胞應在生長良好、致密度約為(wei) 80-90％、數目一般為(wei) 106 -107 /ml，活力達 90%以上的狀態下凍存。細胞活力差的細胞在凍存後的成活率很小，因此，一定要在細胞旺盛分裂時期凍

存。

2、注意冷凍保護劑之品質

DMSO 應為(wei) 試劑級等級，無菌且無色，可以用 0.22 微米濾膜過濾，或者直接購買(mai) 無菌產(chan) 品。以 5-10 ml 小體(ti) 積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

使用 DMSO 前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(hui) 破壞它的分子結構，以至於(yu) 降低冷凍保存效果。在常溫下，DMSO 對人體(ti) 有害，故在配製時最好帶上手套。混勻 DMSO 要快，因為(wei) DMSO 對細胞有毒性，混合後應盡快凍存。尤為(wei) 值得注意的是細胞中加入凍存液後，一定要混勻，防止 DMSO 沉澱。

3、提前配製凍存液

凍存液應該提前配製，置於(yu) 室溫備用，防止臨(lin) 時配製產(chan) 生的熱量損傷(shang) 細胞。

4、實行細胞慢凍的原則

緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nei) 不致產(chan) 生大的冰晶，導致細胞損害。對於(yu) 大多數細胞來說，每分鍾降 1-3℃是合適的。相反，若不緩慢冷凍，造成的結晶就大，大結晶會(hui) 引起細胞膜、細胞器的損傷(shang) 和破裂。複蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。

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