細胞培養(yang) 的基本知識

操作前準備工作：

1.玻璃吸管和玻璃培養(yang) 瓶的消毒：1)高壓蒸汽滅菌15分鍾以上；2)幹烤消毒140度2小時以上；

2.無菌工作台先清洗後用75%酒精擦拭幹淨，紫外線照射40分鍾以上；各種培養(yang) 板照射3小時以上；

3.培養(yang) 基(pH7.2)和血清配製好後要做無菌試驗：將血清按10%加入培養(yang) 基內(nei) ，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yang) 基5-10ml置培養(yang) 箱內(nei) 培養(yang) 2-3天，肉眼見無渾濁或沉澱等異物。分裝後置-20度保存；

4.消化液(pH7.8)或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存；

5.各種凍存的液體(ti) 複溫時應邊搖邊融化，否則有的液體(ti) （特別是培養(yang) 基）容易產(chan) 生沉澱；

6.培養(yang) 箱應先用清水清洗後用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應照射1小時以上，如有高溫滅菌的應按程序來菌）至少每月一次；

7.進入操作時應注意先清洗雙手及手腕，然後用75%酒精擦拭，操作時注意無菌台內(nei) 空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數量較多，培養(yang) 瓶應放在與(yu) 酒精燈平行地方便於(yu) 操作，瓶與(yu) 瓶之間應相隔一定的距離，開瓶（蓋）時應先用75%酒精反複擦拭或用燈燒，開開後應用燈先燒口，然後燒蓋用完後同樣操作，整個(ge) 操作過程盡量在無菌台靠裏麵一點。

複蘇：

1.應遵守慢凍快融的原則，先將水溫鍋調至37-37.5度，取出凍存的細胞迅速放入後交細胞麵浸至水麵以下不斷搖動至融化；

2.在無菌台內(nei) 將完全培養(yang) 基加入50ml的小培養(yang) 瓶內(nei) ，約5ml左右，然後用無菌吸管從(cong) 凍存管內(nei) 取出細胞，置培養(yang) 並內(nei) 輕輕搖晃，使細胞均勻後置培養(yang) 箱內(nei) 培養(yang) 。

傳(chuan) 代：

1.貼壁細胞：

對於(yu) 貼壁細胞應先吸（倒）盡培養(yang) 基，吸的越幹淨越好，以免中和後加入的消化液，使強度減弱，50ml培養(yang) 瓶加入消化液約0.6ml，按此比例進行消化，（根據配製強度經驗），晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yang) 箱約2分鍾，鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落後，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml完全培養(yang) 基後，輕輕吹打，使細胞基本成單個(ge) 懸浮，然後分置其它無菌培養(yang) 瓶內(nei) ，加入完全培養(yang) 基後繼續培養(yang) 或實驗。

2.懸浮細胞：

一般傳(chuan) 代可直接將細胞原液分置其它培養(yang) 瓶內(nei) ，加入完全培養(yang) 基繼續培養(yang) ，如要高濃度可先離心500rpm，5min後加入完全培養(yang) 基，輕輕吹勻後，分置其它培養(yang) 瓶內(nei) 加入完全培養(yang) 基繼續培養(yang) 。

無菌操作：

簡要介紹：

1.將試驗用品放入超淨工作台用紫外線照射30分鍾；2. 照射30分鍾後，進入緩衝(chong) 間，換滅菌的無菌衣，換專(zhuan) 用拖鞋；3.手部用5％的潔爾滅浸泡2分鍾，進入潔淨區後，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作時盡量靠近火焰；6.裝培養(yang) 基的瓶子等不要直接口向上，用一個(ge) 架子斜放，瓶口朝向火焰；7.標準操作，不要讓無菌吸管到處碰來碰去；8.中途出入無菌室，再次操作時，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。

活細胞計數：

1、先消化吹打使細胞盡量變成單細胞懸液；

2、取出細胞液按你的濃度加入台盼蘭(lan) 置室溫5分鍾左右；

3、準備好潔淨的計數板及蓋玻片放在一旁，用玻璃滴管吸取染好並輕輕吹勻的細胞液，將滴管尖端輕輕靠在蓋玻與(yu) 計數板的縫隙間，微微捏一下滴管膠頭細胞自動就被吸到計數板裏了（捏重了細胞不均勻，計數不準，細胞還會(hui) 流出）。

4、在鏡下計數。

四角的4個(ge) 大方格內(nei) 細胞總數÷4×10000=你滴入時細胞液每ml的細胞數。

從(cong) 2011年開始我們(men) 致力於(yu) 在生命科學領域、生物醫學實驗技術及論文潤色服務，協助客戶各類實驗服務及論文潤色十多年，是您值得信賴的科研合作夥(huo) 伴!

如果您受時間、試驗條件等限製而無法完成您的課題研究，歡迎您與(yu) 我們(men) 聯係。

實驗技術服務：