本試劑盒隻能用於(yu) 科學研究，不得用於(yu) 醫學診斷

己烯雌酚（DES）ELISA檢測試劑盒

使用說明書(shu)

檢測原理

試劑盒采用競爭(zheng) 法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被己烯雌酚（DES）抗原包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的競爭(zheng) 抗原，經過溫育並徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的己烯雌酚（DES）呈負相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nei) 毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液後，3000轉離心10分鍾將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鍾取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心10分鍾去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鍾取上清。

5.  保存：如果樣本收集後不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存於(yu) -20℃，避免反複凍融，在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.酶標儀(yi) （450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

操作注意事項

1.   試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鍾。從(cong) 冰箱取出的濃縮洗滌液會(hui) 有結晶，這屬於(yu) 正常現象，水浴加熱使結晶完全溶解後再使用。

2.   實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫幹燥）保存。

3.   按照說明書(shu) 操作時樣本已經稀釋5倍，最終結果乘以5才是樣本實際濃度。

4.   嚴(yan) 格按照說明書(shu) 中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.   所有液體(ti) 組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標準品（S0-S5）濃度依次為(wei) ：0、0.75、1.5、3、6、12 ng/ml

試劑的準備

 20×洗滌緩衝(chong) 液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩衝(chong) 液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.   手工洗板：甩盡孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，靜置1min後甩盡孔內(nei) 液體(ti) ，在吸水紙上拍幹，如此洗板5次。

2.   自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從(cong) 室溫平衡20min後的鋁箔袋中取出所需板條，剩餘(yu) 板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.  樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的競爭(zheng) 抗原50μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體(ti) ，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍幹，如此重複洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nei) ，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

1.  15分鍾內(nei) 在波長450nm的酶標儀(yi) 上讀取各孔的OD值；

2.  百分結合率計算：設S0管計數為(wei) B0，各標準管或樣品管計數為(wei) B，非特異管計數為(wei) NSB，則百分結合率計算公式如下：B/B0=(B－NSB)/(B0－NSB)×100%

3.  logit計算:各標準點或樣品管的logit值計算公式如下:logit=ln(B/B0)/(1－B/B0)

4.  將標準品的OD均值與(yu) 標準品0點的OD均相除，為(wei) 標準點的百分結合率，在log-logit坐標紙上繪圖。

5.  Log-logit雙對數標準曲線：坐標紙上橫軸從(cong) 左至右第一個(ge) 1-9表示為(wei) 第一個(ge) 10進位，第二個(ge) 1-9表示為(wei) 第二個(ge) 10進位。第三個(ge) 1-9表示為(wei) 第三個(ge) 10進位。坐標紙縱軸為(wei) 百分比（1-99），即各標準吸光值的百分結合率。取一條通過各點的直線。要求盡可能多的點在線上，同時剩餘(yu) 的點均勻分布在直線的兩(liang) 邊。樣品也同樣由吸光值計算百分結合率，再從(cong) 縱軸上的相應結合率找到直線上的點，此點對應的橫坐標濃度即為(wei) 樣品的濃度，無須換算。

6.  人工處理：以標準濃度取log值為(wei) 橫坐標，對應的logit值為(wei) 縱坐標在普通坐標紙上或以標準濃度為(wei) 橫坐標，對應的B/B0為(wei) 縱坐標在logit-log坐標紙上畫出標準曲線（理想化時是一條直線）。根據待測樣

品的B/B0可以從(cong) 坐標紙上查出樣品的濃度值。如果使用普通坐標紙，查出的數值應取反對數才是最後的濃度值。

7.  自動處理：使用logit-log或四參數數據處理模式，由電腦自動計算得出結果。

8.  敏感度：1.0 ng/ml

9.  圖例

試劑盒性能

1.  準確性：標準品線性回歸與(yu) 預期濃度相關(guan) 係數R值，大於(yu) 等於(yu) 0.9900。

2.  靈敏度：最DI檢測濃度小於(yu) 0.1 ng/ml。

3.  特異性：不與(yu) 其它可溶性結構類似物交叉反應。

4.  重複性：板內(nei) 、板間變異係數均小於(yu) 15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個(ge) 月

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