E14 小鼠胚胎幹細胞
Mouse Embryonic Stem Cells ,ES-E14TG2a
貨號：YJ-m062（種屬鑒定）
價(jia) 格： 1800.0
規格： 1*106
細胞描述
小鼠胚胎幹細胞。該細胞缺乏 HGPRT（HPRT），並且對 0.06 mM 的 6-硫鳥嘌呤有抗性。當在飼養(yang) 層（胚胎成纖維細胞或 STO 細胞）上培養(yang) 時，細胞保持未分化狀態。在沒有飼養(yang) 層的情況下，細胞自發分化並形成胚胎結構。當注入胚泡中時，細胞可以進入生殖係。在常規的分子基因修飾技術之後，它們(men) 可用於(yu) 重構小鼠胚胎。培養(yang) 時需使用昆明白MEF作為(wei) 飼養(yang) 層細胞。
細胞特性
1） 來源：小鼠，129/Ola品係，胚胎內(nei) 細胞團
2） 形態：球形克隆 貼壁生長
3） 含量：>1x10^6 細胞數
4） 規格：1mL凍存管包裝
5） 用途：僅(jin) 供科研使用
運輸和保存
幹冰運輸：1mL凍存管包裝幹冰運輸，收到後-80度冰箱保存過夜後轉入液氮或直接複蘇，若發現幹冰已揮發幹淨、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有汙染，請立即與(yu) 我們(men) 聯係。
一．培養(yang) 基及培養(yang) 凍存條件準備：
1）準備DMEM 基礎培養(yang) 基 (YJ-0001) 81%
優(you) 質胎牛血清 （YJ-0500） 15 %
GlutaMAX-1穀氨酰胺 ( YJ-0900 ) 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 (YJ-01000) 1%
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉 ( YJ-01100 ) 1%
P/S青黴素-鏈黴素 （YJ-15140-122） 1%
β-巰基乙醇 (YJ-8211) 0.5 mL（1000X)
LIF (YJ-50756) 5μg（10ng/mL）
使用昆明白MEF作為(wei) 飼養(yang) 層細胞。
2）培養(yang) 條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yang) 箱濕度為(wei) 70%-80%。
3）凍存液：完全培養(yang) 液 60%%，FBS 30%%，DMSO 10%%現用現配。
我庫凍存時，體(ti) 積為(wei) 500 μl，預期存活率 70%，每支凍存管的細胞複蘇，3 至4 天後，會(hui) 形成 30 至 40 個(ge) 克隆，建議複蘇至 1 個(ge) T25 培養(yang) 瓶中。
二：細胞處理：
MEF 細胞鋪製：
1. 在 T25 培養(yang) 瓶中加入 0.2%明膠，搖勻後覆蓋底麵即可，於(yu) 37℃細胞培養(yang) 箱至少放置 15 min 以上。
2. 吸除 0.2%明膠，加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完全培養(yang) 液。一般地，一個(ge) T25 培養(yang) 瓶中加入 5 ml MEF 完全培養(yang) 液。
3. 按實驗需要：小鼠胚胎幹細胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；複蘇 MEF 細胞若幹支。將凍存管從(cong) 液氮中取出，置於(yu) 37℃水浴中使之迅速融解，取出後拿到超淨台內(nei) 用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止汙染。
4. 將凍存管內(nei) 細胞懸液轉移至含 2 ml MEF 完全培養(yang) 液的 15 ml 離心管內(nei) ，以1000 rpm，離心 5 min，離心後將上清液吸除，另加入新鮮的 MEF 完全培養(yang) 液 1 ml，重懸後按照一個(ge) T25 培養(yang) 瓶鋪 1´10^6 的 MEF 細胞，平均加入到 T25 培養(yang) 瓶中，輕輕搖勻後置於(yu) 37℃細胞培養(yang) 箱。24 h 以後可以傳(chuan) 入小鼠胚胎幹細胞。
5.複蘇或傳(chuan) 代小鼠胚胎幹細胞前，將 T25 培養(yang) 瓶中的 MEF 完全培養(yang) 液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液輕輕衝(chong) 洗一遍後吸除，加入新鮮的小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液待用。
複蘇：
1.將小鼠胚胎幹細胞凍存管從(cong) 液氮中取出，置於(yu) 37℃水浴中使之迅速融解，取出後拿到超淨台內(nei) 用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止汙染。
2. 將凍存管內(nei) 細胞懸液轉移至含 3-4 ml 小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液的 15ml 離心管內(nei) ，以 1000 rpm，離心 5 min。
3. 離心後將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液 2 ml，吹打懸浮。
4. 重複吹打，製成單細胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 轉移至 1 個(ge) 已經鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yang) 瓶中培養(yang) 。
6. 每天更換小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液。
傳(chuan) 代：
1. 一般在複蘇後第 2-3 天傳(chuan) 代，視克隆大小和密度而定
2. 吸除廢液。
3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕衝(chong) 洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yang) 瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底麵，置於(yu) 37℃培養(yang) 箱內(nei) 消化細胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。
6. 加 2 ml 小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液終止消化。
7. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。
8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液，多次輕輕吹打細胞， 製成單細胞懸液。
9. 加入足量的小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液，吹打混勻，細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yang) 瓶中。一般地，一個(ge) T25 培養(yang) 瓶加入 5-6 ml 培養(yang) 液。放入 37℃培養(yang) 箱內(nei) 培養(yang) 。每天換液。
傳(chuan) 代比例：1:4-1:7
凍存：
1.按傳(chuan) 代的方法將細胞消化下來，製成細胞懸液。
2. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經預冷的凍存液，懸浮細胞。
3. 按每支存管內(nei) 加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內(nei) ，標記細胞名稱、代數、凍存日期等基本信息。
4．將凍存管置於(yu) 程序降溫盒內(nei) ，-80℃過夜，轉入液氮。
凍存液配方：
小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液 60%，ES 級 FBS 30%，DMSO 10%
附：小鼠胚胎幹細胞與(yu) MEF 細胞分離的簡易方法（差速貼壁法）：
1.培養(yang) 中的小鼠胚胎幹細胞，按傳(chuan) 代的操作方法將細胞用胰酶消化並吹打成單細胞懸液後，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎幹細胞完全培養(yang) 液重懸細胞， 吹打混勻，細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養(yang) 皿或培養(yang) 瓶（一般地，一個(ge) T25 培養(yang) 瓶中培養(yang) 的小鼠胚胎幹細胞，在一個(ge) 10 cm 培養(yang) 皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎幹細胞與(yu) MEF 細胞）中。
2. 培養(yang) 皿或培養(yang) 瓶置於(yu) 37°C 培養(yang) 箱內(nei) 靜置 1 小時。
3. 1 小時後，絕大部分 MEF 細胞已貼在培養(yang) 皿或培養(yang) 瓶底麵，而大部分小鼠胚胎幹細胞仍然懸浮在培養(yang) 液中。收取培養(yang) 液，進行後續實驗。
注意事項
1.收到細胞後，若發現幹冰已揮發幹淨、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有汙染，請立即與(yu) 我們(men) 聯係。
2.收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精後放在培養(yang) 箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩定細胞狀態。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，並對細胞進行不同倍數拍照（建議收細胞時就整體(ti) 外觀拍一張照片，觀察培養(yang) 基的顏色和是否有漏液情況，隨後在顯微鏡下拍下細胞狀態，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有汙染情況。作為(wei) 我方進行銷售依據。
3.由於(yu) 細胞狀態受環境、操作和運輸等多方麵因素影響，故本公司隻保證客戶收到細胞後一周內(nei) 的細胞狀態，故客戶需要售後時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發現問題後客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大於(yu) 7天。
4.所有動物細胞均視為(wei) 有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全台內(nei) 操作，並請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌後方能丟(diu) 棄。
從(cong) 2011年開始我們(men) 致力於(yu) 在生命科學領域、生物醫學實驗技術及論文潤色服務，協助客戶各類實驗服務及論文潤色十多年，是您值得信賴的科研合作夥(huo) 伴!
如果您受時間、試驗條件等限製而無法完成您的課題研究，歡迎您與(yu) 我們(men) 聯係。
實驗技術服務：
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