牛肺炎（CBP）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法）

【產(chan) 品名稱】

通用名稱：牛肺炎（CBP）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

【包裝規格】50T/盒

【預期用途】

牛傳(chuan) 染性胸膜肺炎又稱牛肺疫，是由絲(si) 狀支原體(ti) 引起的一種急性或慢性、接觸性傳(chuan) 染病。以肺小葉間淋巴管漿液性炎症，小葉間組織漿液性纖維素性浸潤，肺實質纖維蛋白性壞死性炎症，繼以患病肺部出現貧血性壞死，常伴有漿液性、纖維素性胸膜炎為(wei) 特征。本試劑盒適用於(yu) 檢測呼吸道、肺部等樣本中的牛肺炎，用於(yu) 牛肺炎感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，設計一對牛肺炎特異性引物，結合一條特異性探針，用熒光PCR技術對牛肺炎的核酸進行體(ti) 外擴增檢測，用於(yu) 臨(lin) 床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chu) 存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反複凍融不超過5次，有效期12個(ge) 月。

【適用儀(yi) 器】

ABI 、安捷倫(lun) MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等係列熒光定量PCR檢測儀(yi) 。

【標本采集】

    疑似患病牲畜取呼吸道樣本或胸、肺部樣本進行檢測。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nei) 可保存於(yu) -20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個(ge) 月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴(yan) 禁反複凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從(cong) 3個(ge) 不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻後取0.5g於(yu) 研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水後繼續研磨，待勻漿後轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL於(yu) 1.5mL滅菌離心管中；分泌液樣品直接取100μL於(yu) 1.5mL滅菌離心管中。

1.2 DNA提取

為(wei) 了使實驗結果穩定、有效、可靠，建議使用商品化的DNA 提取試劑盒進行提取，嚴(yan) 格按照對應試劑盒說明書(shu) 進行操作。

2. 試劑配製（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為(wei) N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配製1份)，每測試反應體(ti) 係配製如下表：

3. 加樣（樣本處理區）

將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴增（核酸擴增區）

4.1 將待檢測反應管置於(yu) 熒光定量PCR儀(yi) 反應槽內(nei) ；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體(ti) 係設置為(wei) 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測牛肺炎，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環參數設置：

5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定

設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體(ti) 傾(qing) 斜時，根據分析後圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15範圍內(nei) 調節)、stop值(一般可在5~20範圍內(nei) 調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高於(yu) 陰性對照)，重新分析結果。

5.2 結果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。

可疑：檢測通道35.0<Ct值<38.0，且出現典型擴增曲線的樣本建議重複試驗，重複試驗結果出現Ct值<38.0且有典型擴增曲線者為(wei) 陽性，否則為(wei) 陰性。

陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

6. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結果與(yu) 樣本收集、處理、運送以及保存質量有關(guan) ；

Ø 樣本提取過程中沒有控製好交叉汙染，會(hui) 出現假陽性結果；

Ø 陽性對照、擴增產(chan) 物泄漏，會(hui) 導致假陽性結果；

Ø 病原體(ti) 在流行過程中基因突變、重組，會(hui) 導致假陰性結果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會(hui) 導致假陰性結果；

Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配製不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

Ø 本檢測結果僅(jin) 供參考，如須確診請結合臨(lin) 床症狀以及其他檢測手段。

7. 質控標準

陰性質控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤30；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為(wei) 無效。

8. 性能指標

（1）敏感性：內(nei) 控樣本敏感性為(wei) 100%，綜合評價(jia) 敏感性98%以上。最DI檢測限不低於(yu) 1000copies/ml。

（2）特異性：100%。

（3）穩定性：批內(nei) 及批間差異≤3%。

【注意事項】

Ø 所有操作嚴(yan) 格按照說明書(shu) 進行；

Ø 試劑盒內(nei) 各種組分使用前應自然融化，完全混勻並短暫離心；

Ø 反應液應避光保存；

Ø 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專(zhuan) 用工作服；

Ø 樣本處理、試劑配製、加樣需在不同區進行，以免交叉汙染；

Ø 實驗完畢後用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作台和移液器；

試劑盒裏所有物品應視為(wei) 汙染物對待，並按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理

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