可樂(le) 定檢測試劑盒使用說明書(shu)
【原理】
本試劑盒采用間接競爭(zheng) ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物可樂(le) 定與(yu) 微孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗磺胺的抗體(ti) ，加入酶標記物後，用TMB底物顯色，樣本吸光值與(yu) 其所含可樂(le) 定的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準曲線比較即可得出殘留物可樂(le) 定的含量。
【試劑盒技術指標】
規 格：96孔/盒
靈 敏 度：0.2ppb
檢測時間： 45min
樣本檢測下限：
尿 樣 ………………………………… 0.2ppb
組 織 ………………………………… 0.4ppb
飼 料 …… …………………………… 8ppb
交叉反應率：
可樂(le) 定………………… 100%
樣本回收率：
尿 樣 ……………………… 95%±10%
組 織 ……………………… 85%±15%
飼 料 ……………………… 85%±15%
【試劑盒組成】
2、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）
3、 （標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb
4、 可樂(le) 定高濃度標準溶液（1ml/瓶）100 ppb
5、 酶標記物 7ml…………………………紅色帽
6、 抗體(ti) 工作液 7ml……………………… 綠色帽
7、 底物A液 7ml ……………………棕色帽
8、 底物B液 7ml ……………………黑色帽
9、 終 止 液 7ml ……………………黃色帽
10、 2X濃縮複溶液50 ml ………………藍色帽
11、 2X濃縮洗滌液40 ml ………………白色帽
【 所用儀(yi) 器、試劑】
具備的儀(yi) 器：微孔酶標儀(yi) 、氮氣吹幹裝置、打印機、均質器 、振蕩器、離心機、恒溫箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管
微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl
試 劑： 濃HCl、甲醇、
【實驗前溶液配製】
配液1、將2X濃縮複溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮複溶液+1份去離子水）用於(yu) 樣本的複溶。
配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配製洗滌液。
配液3、 0.1M HCl 溶液
取0.86ml濃HCl加水定溶至100ml。
配液4、樣品提取液溶液
取1ml 0.1M鹽酸加到99ml甲醇中。
【樣本前處理步驟】
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。
（a）尿樣本的處理方法（樣本稀釋倍數：1）
取50µl清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。
由於(yu) 尿液陰性樣本可能會(hui) 產(chan) 生背景幹擾 （在某些情況下幹擾數值在標準2到3之間），所以推薦標準3即0.3ppb作為(wei) 尿液陽性結果的CUT OFF判斷值。
（b）組織樣本的處理方法（樣本稀釋倍數：2）
1． 稱取2 ±0.05g的組織，加入4ml樣品提取液，振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min。
2． 取上清2ml，於(yu) 50℃氮氣或空氣吹幹。
3． 加1 ml正己烷溶解幹燥的殘留物，再加1ml稀釋後的複溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。
4． 取50µl進行分析。
（C）飼料樣品的處理方法（樣本稀釋倍數：40）
1. 稱1.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入4ml樣品提取液，放振蕩器上振蕩2min；室溫 4000r/min以上離心10min；
2. 取出上清液50ul與(yu) 450ul稀釋好的複溶液混合30s。
取50ul上清進行分析。
【酶標免疫分析程序】
操作步驟：
1、 將所需試劑從(cong) 冷藏環境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體(ti) 試劑使用前均須搖勻。
2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存於(yu) 2-8℃。
3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號每個(ge) 樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
4、 加標準品/樣本50µl /孔，然後加酶標記物50μl/孔，再加入抗體(ti) 工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環境反應30min。
5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍幹（拍幹後未被清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺破）
6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環境避光顯色15min。
7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀(yi) 於(yu) 450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nei) 讀完數據），測定吸光度值（OD值）。
【結果判定】
結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與(yu) 可樂(le) 定的含量成負相關(guan) 。
1、 粗略判定
用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出其濃度範圍(ng /ml)。假設樣本1的吸光度值為(wei) 0.221，樣本2的吸光度值為(wei) 0.795，標準液吸光度值分別是：0ppb為(wei) 1.81；0.2ppb為(wei) 1.50；0.6ppb為(wei) 1.114；1.8ppb為(wei) 0.660； 5.4ppb為(wei) 0.318；16.2ppb為(wei) 0.145。則樣本1的濃度範圍是5.4ppb-16.2ppb；樣本2的濃度範圍是0.6ppb-1.8ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中可樂(le) 定實際含量。
2、 定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於(yu) 標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(ge) 標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即：
百分吸光度值（%） ＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪製與(yu) 計算
以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以可樂(le) 定濃度（ng /ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中可樂(le) 定實際含量。
若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
3、標準曲線：
B/B0 (%)
0.2 0.6 1.8 5.4 16.2
(ppb) [µg/kg]
圖1：可樂(le) 定檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現性：
%CV
0 0.2 0.6 1.8 5.4 16.2
(ppb) [µg/kg]
圖2：可樂(le) 定檢測試劑盒的精密度
由多個(ge) 不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出可樂(le) 定檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異係數（%CV）對相應可樂(le) 定濃度作曲線，可以看到在全部範圍內(nei) 變異係數如此之低，可以得到很好的再現性。
【注意事項】
1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會(hui) 導致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會(hui) 伴隨著出現標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會(hui) 出現重複性不好的現象。
4、 反應終止液為(wei) 2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(hui) 引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小於(yu) 0.5個(ge) 單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8、 該試劑盒最佳反應溫度為(wei) 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
【儲(chu) 存】
原包裝應儲(chu) 存於(yu) 2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個(ge) 月;生產(chan) 日期、有效期、生產(chan) 批號見外包裝。
從(cong) 2011年開始我們(men) 致力於(yu) 在生命科學領域、生物醫學實驗技術及論文潤色服務，協助客戶各類實驗服務及論文潤色十多年，是您值得信賴的科研合作夥(huo) 伴!
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