一、實驗原理
　　
　　本試劑盒應用雙抗體(ti) 夾心酶標免疫分析法測定標本中AIF水平。用純化的抗體(ti) 包被微孔板，製成固相抗體(ti) ，往包被單抗的微孔中依次加入AIF抗原、生物素化的抗小鼠AIF抗體(ti) 、HRP標記的親(qin) 和素，經過*洗滌後用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的AIF呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
　　
　　二、試劑盒組成及試劑配製
　　

試劑盒組成	96孔配置	標本的采集及保存 每瓶臨(lin) 用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好後靜置10分鍾以上，然後反複顛倒/搓動以助溶解，其濃度為(wei) 20,000 pg/ml，做係列倍比稀釋後，分別稀釋10,000 pg/ml，5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，樣品稀釋液直接作為(wei) 標準濃度0 pg/ml，臨(lin) 用前15分鍾內(nei) 配製。如配製10,000 pg/ml標準品：取0.5ml 20,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘(yu) 濃度以此類推。 6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨(lin) 用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製（每孔100ul），實際配製時應多配製0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內(nei) 配製。7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨(lin) 用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
濃洗滌液	1×30ml/瓶
酶聯板（Assay plate ）	一塊（96孔）
標準品（Standard）	2瓶（凍幹品）
樣品稀釋液（Sample Diluent）	1×20ml/瓶
檢測稀釋液B	1×10ml
檢測稀釋液A	1×10ml
覆膜	5張
底物溶液（TMB Substrate）	1×10ml/瓶
終止液（Stop Solution）	1×10ml/瓶（2N H2SO4）
說明書(shu)	1份

　　
　　三、標本的采集及保存
　　
　　1.細胞培養物上清：請離心後收集上清，並將標本保存於-20℃，且應避免反複凍融。
　　
　　2.血清：標本請於室溫放置2小時或4℃過夜後於1000xg離心20分鍾，取上清即可檢測，或將標本放於-20℃保存，但應避免反複凍融。
　　
　　3.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集後30分鍾內於2-8°C1000xg離心15分鍾，或將標本放於-20℃保存，但應避免反複凍融。
　　
　　注：標本溶血會影響zui後檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
　　
　　四、操作步驟
　　
　　實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測範圍。
　　
　　1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，餘孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加於酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鍾。
　　
　　為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
　　
　　2.棄去液體，甩幹，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內配製），37℃,60分鍾。
　　
　　3.溫育60分鍾後，棄去孔內液體，甩幹，洗板3次，每次浸泡1-2分鍾，350ul/每孔，甩幹（也可輕拍將孔內液體拍幹）。
　　
　　4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）100ul，37℃，60分鍾。
　　
　　5.溫育60分鍾後，棄去孔內液體，甩幹，洗板5次，每次浸泡1-2分鍾，350ul/每孔，甩幹（也可輕拍將孔內液體拍幹）。
　　
　　6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鍾內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，後3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
　　
　　7.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到後應盡快加入終止液。
　　
　　8.用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液後15分鍾以內進行檢測。
　　
　　注：
　　
　　1.為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放於鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上覆膜或蓋。
　　
　　2.未使用完的酶標板或者試劑，請於2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用。請勿重複使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液
　　
　　3.每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，隻是zui後加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
　　
　　4.建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
　　
　　五、洗板方法
　　
　　手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗台上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩衝液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鍾，根據需要，重複此過程數次。
　　
　　六、自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。
　　
　　七、特異性
　　
　　本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠AIF，且與其它相關蛋白無交叉反應。
　　
　　八、預期應用
　　
　　ELISA法定量測定小鼠血清、血漿或其它相關液體中凋亡誘導因子（AIF）含量。
　　
　　九、概述
　　
　　凋亡誘導因子（apoptosis-inducingfactor,AIF）是位於線粒體膜間隙的一種黃素蛋白。在凋亡信號刺激時，AIF分子從線粒體釋放到細胞漿，然後轉位到細胞核內，引起染色體核周邊凝集和DNA呈大片段斷裂，從而使細胞發生凋亡的特征性改變。AIF所誘導的細胞凋亡是獨立於caspases係統的另一條更原始和更保守的凋亡途徑，因而不受caspases抑製劑的抑製。凋亡與許多眼病的發生具有密切的關係。
　　
　　十、計算
　　
　　以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
　　
　　十一、注意事項
　　
　　1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
　　
　　2.一次加樣時間控製在5分鍾內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
　　
　　3.請每次測定的同時做標準曲線，做複孔。
　　
　　4.如標本中待測物質含量過高，請先稀釋後再測定，計算時請zui後乘以稀釋倍數。
　　
　　5.在配製標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配製，不能混淆。
　　
　　6.底物請避光保存。
　　
　　十二、說明
　　
　　1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和汙染，試劑避免受到微生物的汙染，因為蛋白水解酶的幹擾將導致出現錯誤的結果。
　　
　　2.小心吸取試劑並嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本/標準品，酶結合物或底物時，*個孔與zui後一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重複性。而且，洗滌不充分將影響試驗結果。
　　
　　3.試劑盒保存：部分試劑保存於-20℃，部分試劑保存於2-8℃，具體以標簽上的標示為準。
　　
　　4.濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
　　
　　5.剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
　　
　　6.中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
　　
　　7.所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
　　
　　十三、有效期：6個月
　　
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