細菌RNA提取試劑盒（DNase I）說明書(shu)

RNApure Bacteria Kit（DNase I）

細菌RNA提取試劑盒（DNase I）

Cat. No.   K0539

保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃

其它組分：室  溫

組分說明

                                              Cat. No.              k0539

                                              Kit Size                 50

                                              DNase I                1000 U

                                        10×Reaction Buffer           1000  μl

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2（concentrate）          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Shredder Spin column             50

                                         Spin Column RM               50

                                    Collection Tube（1.5 ml）            50

                                     Collection Tube（2 ml）            100

產(chan) 品簡介

    本試劑盒采用高效、專(zhuan) 一結合核酸的離心吸附柱和*的緩衝(chong) 係統，可從(cong) 細菌或培養(yang) 的動物細胞中快速提取總 RNA。30-40 分鍾內(nei) 即可完成反應，提取的總 RNA 純度*，沒有蛋白質和其他汙染，適用於(yu) RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、體(ti) 外翻譯等實驗。

注意事項

1.  預防RNase汙染，應注意以下幾方麵：

1）使用無RNase的塑料製品和槍頭，避免交叉汙染。

2）玻璃器皿應在使用前於(yu) 180℃高溫下幹烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鍾，用水*衝(chong) 洗後高壓滅菌。

3）配製溶液應使用無RNase的水。

4）操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2.  Buffer  RL 在使用前請加入β-巰基乙醇至終濃度為(wei) 1%，如 1 ml Buffer  RL 加 10 μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的

Buffer RL 4℃可保存 1 個(ge) 月，如出現沉澱，請加熱溶解後使用。

3.  第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5.  如未特殊說明，所有離心步驟均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。

自備試劑：Lysozyme（YJ0887）、β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA專(zhuan) 用）  

操作步驟

 1.   4℃  10,000 rpm（~13,400×g）離心2分鍾收集菌體(ti) （菌體(ti) 量最大不超過1×10⁹ ），小心去除所有上清。

     注意：上清如果有殘留，會(hui) 影響後續的消化過程。

 2.   用含有Lysozyme的100  μl TE緩衝(chong) 液*重懸菌體(ti) ，室溫孵育。具體(ti) 配方和孵育時間如下：

TE 緩衝(chong) 液中 Lysozyme 的終濃度                孵育時間

G 細菌                  400  μg/ml                 3-5 分鍾

                          -

G+ 細菌                 3 mg/ml                   5-10 分鍾

 3.   加入350  μl裂解液RL（使用前請檢查是否加入β-巰基乙醇），渦旋震蕩混勻（此步驟可能出現不溶性沉澱），將溶液與(yu) 沉澱全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過濾柱（Shredder Spin Column）中，10,000 rpm離心 2分鍾。

 4.   向上步得到的濾液中加入250  μl無水乙醇，混勻（此時可能會(hui) 出現沉澱）。將得到的溶液和沉澱一起轉入吸附柱（Spin Column RM）中（吸附柱已裝入2 ml收集管中），10,000 rpm離心1分鍾，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 5.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鍾，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 6.   配製DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1U/μl），混勻，  配製成終體(ti) 積為(wei) 80 μl的反應液。

 7.   向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分鍾。

 8.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鍾，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 9.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 10,000 rpm離心1分鍾,棄廢液。

 10. 重複步驟9。

 11. 將吸附柱放回收集管中，10,000 rpm離心2分鍾。

     注意：這一步的目的是將吸附柱中殘餘(yu) 乙醇去除，乙醇殘留會(hui) 影響後續的酶促反應(酶切、PCR等)。

 12. 將吸附柱裝入新的RNase-Free的1.5 ml  收集管中，向吸附膜的中間加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鍾，10,000 rpm離心1分鍾，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）  RNase-Free Water 體(ti) 積不應小於(yu) 30 μl，體(ti) 積過小影響回收率。

2）  如果要提高RNA的產(chan) 量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重複步驟12。

3）  如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重複步驟12。

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