禽流感病毒H5N1熒光PCR檢測試劑盒

禽流感病毒H5N1亞(ya) 型核酸檢測試劑盒

（RT-PCR熒光探針法）

【產(chan) 品概述】

本試劑盒針對AIV-H5N1高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體(ti) 係中含AIV-H5N1基因組模板的情況下，PCR反應得以進行並釋放熒光信號。利用儀(yi) 器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

【試劑盒組成】

【儲(chu) 存條件及有效期】

-20℃避光保存，避免反複凍融，有效期6個(ge) 月。

【適用儀(yi) 器】

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀(yi) 。

【樣本采集、存放及運輸】

u 樣本采集：各類型樣本按照常規方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應避免反複凍融（最多凍融3次）；

u 運輸：采用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。

【自備試劑】

核酸提取試劑，如QIAGEN公司的 RNA核酸提取試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chan) 品。

【使用方法】

注：所有試劑使用前需*解凍，混合均勻，6,000rpm離心數秒後使用。

1. 樣本處理（樣本處理區）

待檢樣本的核酸提取可采用病毒RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀(yi) 等，具體(ti) 提取方法請參照相關(guan) 說明書(shu) ；陽性對照及陰性對照無需提取，可直接使用。

2. 擴增試劑準備（PCR前準備區）

取N個(ge) （N=陰性對照+待檢樣本+陽性對照）PCR反應管，每管分別加入PCR反應液17.5 μl、混合酶液2.5 μl (也可根據每頭份用量計算N+1份PCR反應液、混合酶液所需總量，兩(liang) 者混勻離心後分裝20 μl至單個(ge) PCR反應管)。

      將所有PCR反應管於(yu) 6,000rpm離心30s，轉移至樣本處理區。

      3. 加樣（樣本處理區）

   在上述的PCR反應管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性對照和陽性對照各5 μl，蓋緊管蓋，於(yu) 6,000rpm離心10s，轉移至擴增區。

   * 注意事項：建議加樣順序是陰性對照、待檢樣本、陽性對照。

      4. PCR擴增（擴增區）

1)      儀(yi) 器設置（以ABI Prism 7500為(wei) 例）

將PCR反應管放入PCR儀(yi) 內(nei) ，按照對應順序設置陰性對照(NTC)、陽性對照(Standard)及待檢樣本(Unknown)。

FAM通道采集AIV-H5熒光信號，HEX通道采集AIV-N1熒光信號。Quencher Dye為(wei) None，參比染料(Passive Reference)為(wei) None。

2)      擴增程序

        42℃ 10min

        95℃ 3min

95℃  5sec

55℃  40sec

        95℃  5sec

        55℃  40sec

        40Cycles中55℃采集熒光信號，反應體(ti) 係為(wei) 25 μl。

【結果分析條件設定】

u 基線（Baseline）設定：應選擇該次實驗指數擴增前所有樣本熒光信號比較穩定的一段區域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點（Start）應避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點（End）應比最早出現指數擴增的樣本Ct值減少1~3個(ge) 循環，建議基線設為(wei) 3~15。

u 閾值(Threshold)設定：將閾值線設定在剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。

【質控標準】

1.   陰性對照的檢測結果應為(wei) 陰性，Ct值＞38或無Ct值，線形為(wei) 直線或輕微斜線，無指數增長期；

2.   陽性對照的檢測結果應為(wei) 陽性，有典型S型擴增曲線或Ct值≤35；

3.   以上要求需在一次實驗中同時滿足，否則該次實驗視為(wei) 無效。

【結果判斷】

1.   陽性：標本檢測結果Ct值≤35並有明顯指數增長期；

2.   可疑：有明顯的指數擴增期，且35＜Ct≤38，此時樣本為(wei) 可疑樣本；對於(yu) 可疑樣本建議複核一次，若複核結果Ct≤38且有指數擴增期，則判定為(wei) 陽性，否則判定為(wei) 陰性；

3.   陰性：無指數擴增期，Ct＞38或無Ct值均判定為(wei) 陰性樣本。

【對檢驗結果的解釋】

【試劑盒使用注意事項】

1.   有關(guan) 實驗室管理規範請嚴(yan) 格按照行業(ye) 行政主管部門頒布的有關(guan) 基因擴增檢驗實驗室的管理規範執行。

2.   本試劑盒僅(jin) 用於(yu) 體(ti) 外檢測。

3.   實驗請嚴(yan) 格分區操作：

第一區：PCR前準備區 — 準備擴增所需試劑；

第二區：樣本處理區 — 待測樣本和對照品處理；

第三區：檢測區 — PCR擴增檢測。

4.   各區物品均為(wei) 專(zhuan) 用，不得交叉使用，避免汙染，實驗後即請清潔工作台；

5.   試劑盒內(nei) 各試劑使用前，充分融化後請稍事離心。

6.   在－20℃保存的樣本裂解產(chan) 物，應在加樣前置室溫解凍，作短暫離心後使用。

7.   分裝有反應液的檢測管裝入密實袋內(nei) 再轉移至樣本區。

8.   加樣時應使樣品*落入反應液中，不應有樣品粘附於(yu) 管壁上，加樣後應盡快封上檢測管蓋。

9.   擴增完畢立即取出檢測管，密封在專(zhuan) 用塑料袋內(nei) ，丟(diu) 棄於(yu) 指D地點。

10.   反應液分裝時應盡量避免產(chan) 生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄露汙染儀(yi) 器。

11.   實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nei) ，並與(yu) 其他廢棄物品一同滅菌後丟(diu) 棄。

12.   工作台及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進行消毒。

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