土黴素酶聯免疫試劑盒說明書(shu)

一、藥物概述及檢測原理

 歐盟第675/92號令中初步規定在肌肉及牛奶中的四環素族化合物的總量不得超過100ppb，在腎髒，肝髒及雞蛋中分別不得超過600 ppb，300 ppb及200ppb。

本公司的土黴素酶聯免疫試劑盒使用生物技術開發，具有方便、快速、靈敏等特點。

本試劑盒利用土黴素抗體(ti) 與(yu) 土黴素可產(chan) 生特異性結合的性質，先在酶標板上預包被抗原，再加入標準品（樣本）和土黴素抗體(ti) ，樣本土黴素藥物與(yu) 固定在酶標板上的抗原競爭(zheng) 土黴素抗體(ti) ，最後加入底物催化顯色。此時顯色深度與(yu) 標準品（樣本）中土黴素藥物的含量成反比。

二、試劑盒內(nei) 包含組分：

v 10×標準品濃縮液：0 ppb、4ppb、12 ppb、36 ppb、108 ppb，0.5mL/瓶。

v 96孔酶標板：1塊

v 土黴素抗體(ti) 工作液：1瓶（7mL/瓶）

v 酶標二抗工作液：1瓶（7mL/瓶）

v 20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）

v 20×濃縮複溶液：1瓶（10 mL/瓶）

v 底物A液：1瓶（7 mL/瓶）

v 底物B液：1瓶（7 mL/瓶）

v 終止液：1瓶（7mL）

v 說明書(shu)

v 蓋板膜

三、用戶需要自備的設備和試劑

儀(yi) 器：

v 酶標儀(yi) （檢測波長450 nm、630 nm）

v 電子天平（精度：0.01 g）

v 離心機（4000 g及以上）

v 生化培養(yang) 箱（可調25℃、37℃、60℃）

v 旋渦振蕩器

v 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）

v 計時器

試劑：（試劑均為(wei) 分析純）

v 去離子水

四、試劑盒特異性

　　　試劑盒與(yu) 其他藥物的交叉反應率：

v 土黴素…………………………100%

v 金黴素…………………………240%

v 四環素…………………………200%

v 強力黴素（多西環素）……………………20%

五、樣本檢測步驟

1. 工作液準備

v 複溶工作液：取1份20×濃縮複溶液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

v 1 M鹽酸溶液：量取1ml濃鹽酸加去離子水11ml溶解混勻即得。

2. 樣品前處理

組織樣本（稀釋倍數：12）

Ø 準確稱取1±0.01 g均質後的組織樣品於(yu) 10 mL離心管中；

Ø 加入5 mL去離子水，劇烈渦動2min；

Ø 4000 g以上，離心10 min；

Ø 取500ul上清液加入500ul複溶工作液（見5.1）中，渦動10min；

Ø 取50ul進行檢測。

蜂蜜樣本（稀釋倍數：10）

Ø 精確稱取1±0.01g蜂蜜樣品於(yu) 10mL離心管中；

Ø 加入2mL去離子水，充分渦動1 min溶解分散；

Ø 取100ul溶解液加入400ul複溶工作液中，渦動1 0S混勻；

Ø 立即取50ul進行檢測。

液態奶樣本方法一（稀釋倍數：10）（同卡那黴素液態奶方法一致）

Ø 將采樣好的液態奶樣本解凍後於(yu) 室溫靜置平衡30min以上；

Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；

Ø 加入50μL 1M鹽酸（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀(yi) 渦動30s）；

Ø 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min；

Ø 取上層清亮液體(ti) 50μL加入另一幹淨離心管中（注意：盡量不要取到最上層的奶油），再加入450μL複溶工作液，強烈震搖1min （或使用渦動儀(yi) 渦動30s）；

Ø 取50 μL液體(ti) 進行分析。

液態奶樣本方法二（稀釋倍數：40）（同卡那黴素液態奶方法一致）

Ø 精確量取50ul液態奶樣品於(yu) 1950ul複溶工作液中；

Ø 充分渦動1 min混勻；

Ø 立即取50ul進行檢測。

飼料（牛飼料、豬飼料）（稀釋係數：200 ）

Ø 準確稱取 1±0.01 g 飼料樣品於(yu)  50mL 離心管中；

Ø 加入 5 mL 去離子水，充分渦動 2min 至飼料*分散；

Ø 4000 g 以上，離心 10 min；

Ø 取40 μL上清液於(yu) 新的離心管中，加入1560μL 複溶工作液 ，充分渦動 30 s；

Ø 立即取 50μL 進行檢測。

3. 檢測

Ø 準備：將要使用的酶標板條插入酶標板架上，並記錄各標準品和樣品的位置，為(wei) 減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個(ge) 樣本/標準品點兩(liang) 孔），未使用的酶標板條用自封袋密封後，保存於(yu) 2-8℃環境中以防變質；

Ø 標準品工作液配製：分別取5個(ge) 2ml離心管，標記為(wei) 0、0.4、1.2、3.6、10.8ppb；於(yu) 每個(ge) 管中加入900ul複溶工作液，於(yu) 對應管中加入100ul10×標準品濃縮液（0—0、0.4—4、1.2—12、3.6—36、10.8—108）；

Ø 加樣：向對應微孔中加入標準品工作液/樣品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL酶標二抗工作液，再向每孔中加入50 μL抗體(ti) 工作液；

Ø 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內(nei) 液體(ti) 充分混勻後，蓋好蓋板膜於(yu) 25℃避光反應30 min；

Ø 洗滌：取出酶標板後小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體(ti) 後，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s後倒掉洗滌工作液，然後再加入洗滌工作液重複洗滌3~4次後，將酶標板倒置於(yu) 吸水紙上，用力拍幹；

Ø 顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體(ti) 積1:1充分混合，混合液在10 min內(nei) 使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質失效）；

Ø 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內(nei) 液體(ti) 充分混勻後，蓋好蓋板膜於(yu) 25℃避光反應15 min；

Ø 終止：在反應後的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍變黃表明終止成功。

Ø 讀數：終止後的酶標板應在5 min內(nei) 用酶標儀(yi) 讀數，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標板吸光度值。

4. 計算結果

Ø 設各標準品（或樣品）的吸光度平均值為(wei) B，零標準（濃度為(wei) 0 ppb的標準品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%為(wei) 各標準品（或樣品）對應的吸光度的百分比：

Ø 使用半對數係統代入標準品對應的吸光度的百分比，與(yu) 標準品濃度擬合出標準曲線。

Ø 將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中，即可得出樣品對應的濃度，最後乘以樣品相應的稀釋倍數，即可得出樣品中檢測物含量。

六、試劑盒參數

Ø 試劑盒靈敏度：0.4 ppb；

Ø 標準曲線範圍：0.4 ppb-10.8ppb；

Ø 板內(nei) 變異係數：<5%；

Ø 板間變異係數：<15%；

Ø B0吸光度最佳值：>0.8；

Ø 回收率：90%±15%

Ø 樣品最低檢測限：

　 組織……………………………約12ppb

   蜂蜜……………………………約20ppb

   液態奶樣本方法一……………約20ppb

   液態奶樣本方法二……………約40ppb

   飼料……………………………約600ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

七、分析限製

　　　本試劑盒為(wei) 定量或半定量試劑盒，建議用於(yu) 大量樣本篩查分析。若檢測結果為(wei) 陽性，建議使用儀(yi) 器方法開展確證實驗（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

八、試劑盒貯存條件

Ø 試劑盒最佳貯存溫度為(wei) 2-8℃，切勿凍存。

Ø 未使用完的酶標板須密封保存2-8℃的環境中。

九、注意事項

Ø 使用試劑盒前，請務必仔細閱讀說明書(shu) 。

Ø 試劑盒使用前，需將盒內(nei) 各組份置於(yu) 實驗台上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。

Ø 試劑使用前需搖勻，混合時應避免出現氣泡。

Ø 槍頭為(wei) 一次性用品，為(wei) 防止試劑交叉汙染，檢測過程中所用槍頭不得重複使用。

Ø 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。

Ø 樣品處理完畢後請立即分析，否則可能影響檢測結果。

Ø 底物A液、底物B液均為(wei) 無色透明液體(ti) ，若在使用前已變成藍色，或混合後立即變藍，說明試劑已汙染或變質。

Ø 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應時間差對檢測結果產(chan) 生影響。

Ø 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水衝(chong) 洗。若不慎入眼，請在*清洗後去醫院檢查。

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