克倫(lun) 特羅快速檢測試劑盒說明書(shu)
一、原理
本試劑盒采用間接競爭(zheng) ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物克倫(lun) 特羅將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗克倫(lun) 特羅抗體(ti) ，加入酶標記物後，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與(yu) 其所含殘留物克倫(lun) 特羅的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準曲線比較即可得出相應殘留物克倫(lun) 特羅的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.1ppb
孵育溫度： 25℃
孵育時間： 30min～15min
樣本檢測下限
尿 樣 0.1ppb
組 織（處理法一） 0.4ppb
組 織（處理法二） 0.1ppb
飼 料 1ppb
交叉反應率
克倫(lun) 特羅（Clenbuterol） 100%
特pu他林（Terbutalin） <1%
馬布特羅(Mabuterol) <1%
溴布特羅(Brombuterol) <1%
沙丁胺醇（Salbutamol ） <1%
萊克多巴胺（Ractopamine） <1%
樣本回收率
尿 樣 95%±22%
組 織 75%±20%
飼 料 80%±20%
三、試劑盒組成
1 微量測試孔 每條 8 孔，一板 12 條
標準液×6 瓶 0ppb 0.1ppb
2 0.3ppb 0.9ppb
（1ml/瓶）
2.7ppb 8.1ppb
3 酶標記物 7ml 紅色帽
4 抗體(ti) 工作液 10ml 藍色帽
5 底物 A 液 7ml 白色帽
6 底物 B 液 7ml 黑色帽
7 終止液 7ml 黃色帽
四、所用儀(yi) 器、試劑
具備的儀(yi) 器：酶標儀(yi) 、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀(yi) 、恒溫箱、打印機
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、
甲醇、無水硫酸鈉、正己烷
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。
u 樣本前處理需配製：
配液 1 0.1M HCl 溶液取 0.86ml 濃 HCl 加水定溶至 100ml。
配液 2 0.1M NaOH 溶液稱取 0.4g NaOH 加水定溶至 100ml。
配液 3 乙腈-0.1M HCl 溶液V 乙腈：VHCl =84：16。
樣本處理：
（a）尿樣本的處理方法
取 20µl 清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或 4000r/min 離心 10min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。 3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決(jue) 於(yu) 樣本稀釋倍數: 1 倍 洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定
（b）組織樣本的處理方法一 程序中的要點。
1、稱 2±0.05g 均質後的組織至 50ml 離心管中，加 4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜入 6ml 去離子水，充分振蕩 2min，室溫 蓋住微孔板。
4000r/min 以上離心 10min(注：若組織樣本中油 u 操作步驟：
脂含量較高，可在振蕩後放入 85℃水浴 10min 1、從(cong) 2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～後再離心)； 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體(ti) 試劑使
2、取 20µl 上層液進行分析。 用前均須搖勻。
樣本稀釋倍數: 4 倍 2、取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放
（c）組織樣本的處理方法二 入自封袋，保存於(yu) 2～8℃。
1、稱取 2 ± 0.05g 均質後的組織於(yu) 50ml 離心管 3、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每中，加入 6ml 乙腈-0.1MHCl，振蕩 2min,室溫 個(ge) 樣本和標準品做 2 孔平行，並記錄標準孔和
4000r/min 以上離心 10min； 樣本孔所在的位置。
2、取上清 3ml，加入 2ml 0.1M NaOH，加入 6ml 4、加標準品/樣本 20µl/孔到各自的微孔中，然後加乙酸乙酯，振蕩 1min，室溫 4000r/min 以上離 酶標記物 50µl/孔，再加入 80µl/孔的抗體(ti) 工作心 10min。取全部上清於(yu) 50～60℃氮氣流或空 液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環境氣流吹幹； 反應 30min。
3、加入 1ml 去離子水溶解幹燥後的殘留物，混合 5、將孔內(nei) 液體(ti) 甩幹，用去離子水 250µl/孔洗板 4～30s； 5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍幹（拍
4、取 20 µl 用於(yu) 分析。 幹後未清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺破）。
樣本稀釋倍數： 1 倍 6、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B
（d）飼料處理方法 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯
1、稱1.0±0.05g 研碎的飼料樣品於(yu) 50ml 離心管中， 色 15min。
加入 10ml 甲醇，再加入 5g 無水硫酸鈉，充分 7、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設振蕩 2min；15℃ 4000r/min 以上離心 10min； 定酶標儀(yi) 於(yu) 450nm 處（建議用雙波長 450/630n
2、吸出離心後的上清液 1ml，於(yu) 50～60℃氮氣流 m 檢測，5min 內(nei) 讀數），測定每孔 OD 值。或空氣流吹幹，用 1 ml 去離子水溶解幹燥後的 七、結果判定殘留物，再加入 1ml 正己烷混合 30s ；15℃ 結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第 1 種方4000r/min 以上離心 5min；去除上層有機相；
法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與(yu)
3、取下層 20 µl 用於(yu) 分析。
其所含克倫(lun) 特羅量成負相關(guan) 。
樣本稀釋倍數：10 1、粗略判定：
六、酶標免疫分析程序: 用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出
u 測定前應須知： 其濃度範圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為(wei) 0.3，
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 樣本 2 的吸光度值為(wei) 1.0，標準液吸光度值分別是：（20～25℃）。 0ppb 為(wei) 2.243； 0.1ppb 為(wei) 1.816；0.3ppb 為(wei) 1.415；
2、 使用之後立即將所有試劑放回 2～8℃。 0.9ppb 為(wei) 0.74；2.7ppb 為(wei) 0.313；8.1ppb 為(wei) 0.155。則樣本 1 的濃度範圍是 2.7ppb～8.1ppb；樣本 2 的濃度範圍是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中克倫(lun) 特羅實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於(yu) 標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(ge) 標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即B百分吸光率（%）＝ ×100%B0
（2）B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪製與(yu) 計算以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以克倫(lun) 特羅標
準品濃度（ng/ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中克倫(lun) 特羅實際濃度。
若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。
八、注意事項:
1、室溫低於(yu) 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會(hui) 導致所有標準的 OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會(hui) 伴隨著標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。
3、混合要均勻，否則會(hui) 出現重複性不好的現象。
4、反應終止液為(wei) 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(hui) 引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品 1 的吸光度值小於(yu) 0.5 時，表示試劑可能變質。
8、該試劑盒最jia反應溫度為(wei) 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
九、儲(chu) 藏條件和保質期
1、儲(chu) 藏條件：試劑盒於(yu) 2-8℃保存，不要冷凍。
2、保 質 期：該產(chan) 品有效期為(wei) 1 年，生產(chan) 日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
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