Protein A+G瓊脂糖凝膠說明書(shu)

Protein A+G Agarose  

Cat. No.   K0349    

保存：2-8  ℃

組分說明

                                              Cat.No.         K0349

                                              Volume         2 ml

產(chan) 品簡介

       本產(chan) 品為(wei) Protein A 和  Protein G  共價(jia) 交聯到4% Agarose beads 上的產(chan) 物，並保存在含有0.05%疊氮鈉的TBS 緩衝(chong) 液中，2 ml Protein A+G Agarose 中共含有 0.5 ml Agarose beads，約2 mg 重組的Protein A+G。主要用於(yu) 免疫沉(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉澱(Co-IP)，也可以用於(yu) 抗體(ti) 的純化。適用於(yu) 免疫沉澱所有Protein A Agarose 和Protein G Agarose 單獨可以免疫沉澱的抗體(ti) ，包括Mouse IgG1，IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, Rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, Rabbit IgG, Rabbit and Goat polyclonal Abs，以及Human IgG1, IgG2,IgG3 和IgG4。本產(chan) 品如果用於(yu) 常規的免疫沉澱，可以免疫沉澱100 次。

注意事項

1. 請勿冷凍保存本產(chan) 品。

2. Protein A+G Agarose 使用前一定要充分重懸，即充分顛倒若幹次使混合均勻。

3. 從(cong) 蛋白樣品收集開始，所有步驟中蛋白樣品都必須在4℃或冰上操作。

4. 為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

操作步驟

1.  免疫沉澱(Immunoprecipitation, IP)：

1.1.  蛋白樣品的準備：

1.1.1  對於(yu) 10 cm細胞培養(yang) 皿中的貼壁細胞，吸除細胞培養(yang) 液，PBS洗滌一次，然後加入500  μl至2 ml細胞裂解液裂解細胞。

1.1.2.  對於(yu) 組織樣品參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解。

1.1.3.  對於(yu) 懸浮細胞，離心收集細胞後，PBS洗滌一次，然後參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解。

      注：  詳細的裂解方法參考不同裂解液的詳細使用方法。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當稀釋，如果蛋白樣品濃度過低，在以後的裂解過程中宜適當減少裂解液的用量。

1.2.  去除非特異性結合(可選做)：

1.2.1.  取200  μl至1 ml蛋白樣品，蛋白量約為(wei) 200  μg至1 mg，加入約1微克和免疫沉澱時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20  μl充分重懸的Protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動30分鍾至2小時。

1.2.2. 2500 rpm(約1000 g)離心5分鍾，取上清用於(yu) 後續的免疫沉澱。

       注：  所謂種屬相同的IgG是指，例如後續免疫沉澱時用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無normal IgG可以加入其它不影響後續檢測的其它mouse IgG類型的抗體(ti) 。通過和normal IgG和Protein A+GAgarose的孵育，可以充分降低非特異性的結合，降低背景。

1.3.  免疫沉澱：

1.3.1.  加入0.2-2 μg用於(yu) 免疫沉澱的一抗，4℃緩慢搖動過夜。

1.3.2.  再加入20 μl充分重懸的Protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動1-3個(ge) 小時。(為(wei) 方便後續的洗滌操作可以把加入充分重懸的Protein A+G Agarose的量調整為(wei) 40微升。)

1.3.3. 2500 rpm(約1000 g)離心5分鍾，或瞬時高速離心，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。

1.3.4.  用準備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉澱5次，裂解液或PBS的用量每次為(wei) 0.5-1 ml。洗滌時離心條件和吸除上清的要求同上麵的步驟C3。

1.3.5.  完成最後一次洗滌後，去除上清，加入20-40  μl 1XSDS-PAGE電泳上樣緩衝(chong) 液Vortex重懸沉澱，瞬時高速離心把樣品離心至管底。

1.3.6. 100℃或沸水浴處理3-5分鍾，取部分或全部樣品用於(yu) SDS-PAGE電泳，暫時不用的樣品可以-20℃保存。

2.  免疫共沉澱：

   參考免疫沉澱的方法進行，但免疫共沉澱(CO-IP)通常必須使用未經凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉澱雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為(wei) 佳。

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