TB基因分型試劑盒 VNTR-9

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其它相關(guan) 產(chan) 品        

k2571

TB  基因分型試劑盒 HV-3

產(chan) 品簡介

本試劑盒是以分子流行病學新一代研究進展

1）

為(wei) 基礎，經工藝優(you) 化後形成的人型結核分枝杆菌基因分型產(chan) 品。本產(chan) 品利用

結核分枝杆菌基因組中可變數目串聯重複序列（variable-number tandem repeats, VNTR）多態性進行基因型分型區分臨(lin)

床菌株，是研究結核分枝杆菌分子流行病學和監測結核病傳(chuan) 播狀況的有力工具。與(yu) 現有其它基於(yu) VNTR原理的結核分枝杆菌

VNTR分型係統相比，這一分型係統對中國流行的菌株具有更強的分辨能力1，2，3），因此特別適合於(yu) 中國用戶的需求。

通過對各PCR反應引物序列和預混反應液成份進行精心優(you) 化，使得本產(chan) 品具有很強的抗幹擾力。與(yu) 用戶自配試劑相比，

本產(chan) 品顯著提升了特異條帶信號強度，降低了使用粗製模板（煮沸菌液）時非特異條帶的出現率，使實驗操作更加簡便、快

捷的同時，提高了檢測成功率。本產(chan) 品的預混反應液化學穩定性良好，能有效抵抗反複凍融（10次）和較長時間（一周）

的室溫環境，更好地適應了用戶檢測工作中的靈活性需求。

本產(chan) 品將人型結核分枝杆菌（MTBC）鑒定、非結核分枝杆菌（MOTT）及模板質量鑒定、結核分枝杆菌北京家族菌株

鑒定，和後續的9位點VNTR分型鑒定整合在一個(ge) 試劑盒中，使用戶僅(jin) 需一個(ge) 試劑盒、12個(ge) PCR反應即可獲得待測菌株基因

型鑒定所需的完整信息。檢測的分辨力指數（Hunter-Gaston index，HGI）可達0.989  。並且，基因型鑒定結果可數字

化記錄，使得不同樣本批次，不同地區，不同時間，不同研究者之間的實驗數據可以很方便地進行比對和匯集分析，

提高了數據的使用效率。

對鑒定為(wei) VNTR-9基因型成簇（所有9個(ge) 位點具有相同重複數）的樣本，若要判定菌株間是否存在近期傳(chuan) 播關(guan) 係，需使用

配套產(chan) 品TB基因分型試劑盒HV-3（貨號K2571），做進一步的分型鑒定。VNTR-9與(yu) HV-3兩(liang) 個(ge) 產(chan) 品的結合使用可將檢測

的HGI提升至0.993  。關(guan) 於(yu) TB基因分型試劑盒HV-3（貨號K2571）產(chan) 品的更多信息請見其產(chan) 品說明書(shu) 。

1）

參考文獻

1） Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium

tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)

2） Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping

Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)

3） Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype

strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.

注意事項

1.為(wei) 避免汙染，建議製備樣本和配製 PCR Mix 在不同的地點內(nei) 進行，並使用不同的移液器。

2.在樣本 DNA 的收集，抽提和擴增的所有環節都應注意作好標記，同時防止不同樣本間發生交叉汙染。

3.常用試劑和耗材在實驗前需高壓滅菌。

4.每管 PCR Mix 中均含有不同的引物，不可混用。可根據實驗需求一次性分裝為(wei) 不同的量，避免反複凍融。

5.為(wei) 避免打開反應管時，反應液飛濺，開蓋前請短暫離心，收集液體(ti) 於(yu) 管底。若不小心濺到手套或桌麵上，應立刻更換手

套並用 75%酒精或稀酸擦拭桌麵。

6.吸取時注意不要交叉汙染 PCR Mix，建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。

7.

實驗前準備：1×TE  緩衝(chong) 液（PH=8.0）、0.5×TBE 緩衝(chong) 液、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、普通 PCR 儀(yi) 、DNA 電泳設備和

凝膠成像儀(yi) 、0.2 ml PCR 反應管、八聯排或 96 孔 PCR 管、不同規格的移液器：0.5-10 μl 和 20-200 μl。

操作步驟

1.

DNA 模板製備：

1.1  從(cong) 固體(ti) 培養(yang) 基上刮取少量（1-2 接種環）樣本，重懸於(yu) 100 μl TE 中，80°C 滅活 30 分鍾。

1.2  滅活後的菌株拿出 P3 實驗室進行如下操作：

100°C 煮沸 10 分鍾（煮沸時 EP 管蓋子可能會(hui) 爆開，要盡量避免，扣緊 EP 管，不要讓水進入管中），立即置於(yu) 冰上 2

分鍾，12,000 rpm（~13,400×g）離心 10 分鍾後，取上清置於(yu) 另一無菌 EP 管中，做上標記，-20°C 保存。

2.

檢測程序：

2.1   取出 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9，待液體(ti) 平衡到室溫後，輕微搖晃 3-4 次混勻，12,000 rpm 離心 5 秒，使蓋上的

液體(ti) 收集到管內(nei) 。

2.2  結核分枝杆菌基因型分析：

2.2.1  鑒定樣本是否為(wei) 人型結核分枝杆菌（重要！此步驟不可省略！）：

A．PCR 擴增：反應體(ti) 係為(wei) 20 μl。

在每個(ge) PCR 管中分別加入 19 μl Mtb 鑒定 PCR Mix，1 μl DNA 模板，混勻。

B．反應程序：

C.

製膠，電泳

使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產(chan) 物進行電泳。

配製 1%的瓊脂糖凝膠，12×6 cm 膠盤製膠，每塊膠為(wei) 40 ml。

1）稱取 0.4 g 瓊脂糖，加入 40 ml 0.5×TBE，在天平上稱重後放入微波爐，高火加熱 2-3 分鍾，使瓊脂糖*溶化，搖

勻，觀察為(wei) 均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補入適量的雙蒸水，以保持膠凝膠的濃度不受影響。

2）待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 2 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子製膠，將

溫熱的凝膠澆灌入膠盤。

3）待凝膠*凝結（室溫下放置 30 分鍾），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩衝(chong) 液，

沒過膠麵 1-2 mm。

4）PCR 產(chan) 物上樣：每個(ge) 孔中加入 3 μl PCR 產(chan) 物，每塊膠上留一個(ge) 孔加入 5  μl MarkerⅠ，每塊膠上加一個(ge) H37Rv 作

為(wei) 質量控製。電壓 150V，電泳時間為(wei) 45 分鍾。

結果顯示：

D．結果分析：

1）如果出現了 850 和 361 bp 兩(liang) 條帶，則說明模板 DNA 是人型結核分枝杆菌，可進入第 F 步（見後麵）進行結核分枝杆

菌北京基因型的分析鑒定，並進一步使用本試劑盒對該菌株進行 9 位點 VNTR 基因型分析鑒定。

2）如果隻擴增出 850 bp 的條帶，則說明該菌株屬於(yu) 結核分枝杆菌複合群，但不是人型結核分枝杆菌，不適用本產(chan) 品進行

基因型分析鑒定。

4）如果沒有特異性條帶擴增，則說明該菌株是非結核分枝杆菌或模板 DNA 質量不好，不適用本產(chan) 品進行基因型分析鑒定，

可放棄該樣本，或進入第 E 步（見後麵），檢測 DNA 模板的質量。

E．DNA 模板質量鑒定：

若在以上步驟 A-D 中沒有特異性條帶擴增，則說明模板 DNA 質量不佳或該菌株並非結核分枝杆菌，出現此種情況請

進行如下操作。

1）PCR 擴增：反應體(ti) 係為(wei) 20 μl。

在每個(ge) PCR 管中分別加入 19 μl 16S rRNA PCR Mix，1  μl DNA 模板，混勻。

2）反應程序：

3）電泳

1%瓊脂糖凝膠電泳，150V 電泳 45 分鍾；

4）結果顯示：

5）結果分析：

所有細菌中都存在 16S rRNA 序列，如果樣本無擴增產(chan) 物，說明模板 DNA 的數量或質量不足以進行 VNTR 基因分型

檢測。如果有擴增產(chan) 物條帶出現，則說明此菌株為(wei) 非結核分枝杆菌，不應使用本試劑盒進行基因分型鑒定。

F．北京基因型菌株鑒定方法：

在確定菌株為(wei) 結核分枝杆菌後，進一步區分是否屬於(yu) 北京基因型菌株。

1）PCR 擴增：反應體(ti) 係為(wei) 20 μl。

在每個(ge) PCR 管中分別加入 19 μl RD105 PCR Mix，1  μl DNA 模板，混勻。

2）反應程序：

3）電泳

1%瓊脂糖凝膠電泳，150V 電泳 45 分鍾。

4）結果顯示：

5）結果分析：

如果擴增產(chan) 物為(wei) 1495 bp，該菌株為(wei) 非北京基因型菌株；

如果擴增產(chan) 物為(wei) 786 bp，該菌株為(wei) 北京基因型菌株。

2.2.2  結核分枝杆菌 9 位點 VNTR 基因型分型法：對結核分枝杆菌臨(lin) 床菌株進行基因型分析，初步鑒定成簇菌株。

A．PCR 擴增：反應體(ti) 係為(wei) 20 μl。

取 9 個(ge) PCR 反應管，在每個(ge) PCR 管中分別加入 19  μl QUB-11b，QUB-18，QUB-26，MIRU26，MIRU31，MIRU40，

Mtub21，Mtub04，VNTR2372 的 PCR Mix，加入 1 μl DNA 模板，混勻。

B .  反應程序：

C.  製膠、電泳：

C-1：注意事項：

重要！每次實驗需要設置陽性（H37Rv 菌株 DNA）和陰性對照（去離子水）。

關(guan) 鍵！本實驗是以瓊脂糖凝膠電泳為(wei) 基礎來判讀 VNTR 位點基因型，因此，為(wei) 了使不同實驗室結果能準確的相互比較，

在電泳這一步必須要按照統一的標準操作，應注意以下幾點：

1）  製膠所用梳子為(wei) 18 孔。

2） 凝膠左右邊上的兩(liang) 個(ge) 孔由於(yu) 在電泳過程中容易使條帶變形，影響結果判讀，舍棄不用，或者在其中一個(ge) 孔點上陰性對

照，剩餘(yu) 16 孔分為(wei) 12 個(ge) 樣本，3 個(ge) DNA Marker 和 1 個(ge) 陽性對照。點樣順序分別為(wei) “1，2，M，3，4，5，6，M，

7，8，9，10，M，11，12，H37Rv”，數字代表樣本，M 代表 DNA Marker。

3） PCR 擴增產(chan) 物進行首ci電泳並使用 Marker  I 時，凝膠濃度為(wei) 1%，應使用兩(liang) 電極間距離不小於(yu) 30 厘米的電泳槽，電

壓為(wei) 150V，時間為(wei) 100-120 分鍾。

4） 如果擴增產(chan) 物片段過大（>1000bp），需要再次電泳並使用 Marker  II 時，凝膠濃度為(wei) 0.8%，應使用兩(liang) 電極間距離不

小於(yu) 30 厘米的電泳槽，電壓 150V，時間為(wei) 150 分鍾。

C-2：製膠以及電泳過程：

使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產(chan) 物進行電泳。

配製 1%的瓊脂糖凝膠，12×12 cm 膠盤製膠，每塊膠為(wei) 80 ml。

1）稱取 0.8 g 瓊脂糖，加入 80 ml 0.5×TBE，在天平上稱重後放入微波爐，高火加熱 2-3 分鍾，使瓊脂糖*溶化，搖勻，

觀察為(wei) 均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補入適量的雙蒸水，以保持膠的濃度不受影響。

2）待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子製膠，將溫

熱的凝膠澆灌入 12×12 cm 膠盤。

3）待凝膠*凝結（室溫下放置 40 分鍾），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩衝(chong) 液，

沒過膠麵 1-2 mm。

4）上樣電泳：每塊膠中加入 12 個(ge) 樣本（最邊上的孔不加樣），每個(ge) 孔中加入 3-5 μl PCR 產(chan) 物，同時每塊膠上加三個(ge) 5 μl

DNA MarkerⅠ，加一個(ge) H37Rv 作為(wei) 質量控製（點樣孔分布見下圖）。電壓 150V，電泳時間為(wei) 100-120 分鍾。本步驟

是各位點最終讀數是否準確的關(guan) 鍵，需要統一按照此標準操作。

5）部分位點（QUB-18 及 QUB-26）在臨(lin) 床菌株中存在擴增產(chan) 物大於(yu) 1000 bp 的情況，對這些擴增產(chan) 物再利用 0.8%瓊脂

糖凝膠進行電泳，同時加入 DNA MarkerⅡ 作為(wei) 條帶大小對照，電壓 150V，電泳時間 150 分鍾。

MarkerⅠ

MarkerⅡ

D.  結果分析：

根據各臨(lin) 床菌株擴增條帶與(yu) Marker 相對位置，利用凝膠分析軟件讀出每個(ge) 條帶的大小。利用各 VNTR 位點重複單元讀

數表及 VNTR 位點讀數規則，計算出各菌株在該位點的重複單元數，每個(ge) VNTR 位點重複單元讀書(shu) 表及 VNTR 位點讀數規

則附後。

結果報告：  Excel 文件（以下表格為(wei) 結果報告輸出格式舉(ju) 例）

比較不同菌株 9 個(ge) VNTR 位點的重複數，進行成簇分析：如果兩(liang) 個(ge) 或兩(liang) 個(ge) 以上菌株具有相同 9 位點基因型，則初步鑒

定為(wei) 成簇菌株，如有必要，可使用配套產(chan) 品，K2571， TB  基因分型試劑盒  HV-3，做更精細的進一步分型鑒定。如果

分離的菌株具有特異的 9 位點基因型，則鑒定為(wei) 單一菌株。

附錄 1：VNTR 位點讀數規則

附錄 2 ：VNTR 位點重複單元讀數表

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