Ni瓊脂糖凝膠說明書(shu)
Ni-Agarose Resin for 6×His-Tagged Proteins
目錄號： K0010
保 存： 20%乙醇中 2-8℃保存
組分說明
Cat.No. K0010A K0010C
Volume 10ml 100ml
產(chan) 品簡介
該鎳柱純化係統對6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有 6 個(ge)
組氨酸親(qin) 和標簽的蛋白。該係統具有4 個(ge) Ni2+ 螯合位點，較隻有3 個(ge) 螯合位點的Ni-IDA 結合
Ni2+更為(wei) 牢固，有效防止純化過程中Ni2+脫落且增強對His 標簽蛋白的結合能力，提高純化效
率。較高的基團密度，大大提高了蛋白載量。該係統在天然或變性條件下，對來源於(yu) 各種表達
係統（如杆狀病毒，哺乳細胞，酵母以及細菌）中的H標簽蛋白，均有很好的純化效果。本產(chan)
品已螯合鎳離子，可直接使用，方便，快捷。
支持物：CL-6B 瓊脂糖凝膠
載量：20-30mgHis標簽蛋白/ml 填料
粒徑：50-160μm
注意事項
1. 緩衝(chong) 液中不建議使用β-巰基乙醇、DTT 和EDTA。
2. 整個(ge) 純化過程中切忌凝膠脫水變幹。
3. 為(wei) 提高純化效率，首先確定BindingBuffer 和 ElutionBuffer 中咪唑的+*佳使用濃度。可
以使用線性或梯度濃度的咪唑（20-500mM）洗脫蛋白，並通過SDS-PAGE 或 WesternBlotting
來檢測目的蛋白的純度。
4. 請使用高純度的試劑配製緩衝(chong) 液，並通過0.45µm 過濾器過濾。為(wei) 避免柱子被堵塞，建議
將裂解液進行離心，或者使用 0.45µm 過濾器過濾。
5. 柱再生時，保證每步洗完後都要用足夠的去離子水衝(chong) 洗至中性。
操作步驟
組裝層析柱
1. 將填料混勻後加入層析柱，室溫靜置10 分鍾，待凝膠與(yu) 溶液分層後，把底部的出液口打
開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。
注意：（1）填料的上層是乙醇保護層，將填料和乙醇一起混勻，以每ml填料純化20-30mgHis
標簽蛋白計算，取需要的填料與(yu) 乙醇的混合液加入層析柱。
（2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個(ge) 外力，例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流
出。
（3）本實驗都是通過重力作用使溶液流出。
2. 向裝填好的柱中加入5 倍柱體(ti) 積的去離子水將乙醇衝(chong) 洗幹淨後，再用 10 倍柱體(ti) 積的
Binding Buffer 平衡柱子，平衡結束後即可上樣。
注意：柱體(ti) 積指的是填料的體(ti) 積。
I 可溶性蛋白的純化（SolubleBindingBuffer和SolubleElutionBuffer配方詳見附表1）
1. 收集菌體(ti) 後，每100mg菌體(ti) （濕重）加入1-5 ml細菌裂解液，超聲裂解菌體(ti) 。
2. 將菌體(ti) 裂解液負載上柱，流速為(wei) 10倍柱體(ti) 積/小時。
3. 使用15倍柱體(ti) 積的Soluble Binding Buffer衝(chong) 洗柱子，收集流穿峰。
4. 使用5倍柱體(ti) 積的Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。
5. 洗脫後，依次使用3倍柱體(ti) 積的Soluble Binding Buffer和5倍柱體(ti) 積的去離子水洗滌柱子，
再用3倍柱體(ti) 積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），4℃保存。II 包涵體(ti) 蛋白的純化
（InclusionBodyBindingBuffer和 InclusionBodyElutionBuffer配方詳見附表2）
1. 收集菌體(ti) 後，每100mg菌體(ti) （濕重）加入1-5 ml 細菌裂解液，超聲裂解菌體(ti) 。
2. 離心，棄上清，將沉澱重懸於(yu) Soluble Binding Buffer中（如有需要，可進行超聲波處理，超
聲前可加入1-5mM磷酸酶抑製劑混合物）。
3. 重複操作2，直至包涵體(ti) 清洗幹淨（呈較潔淨的乳白色狀）。
4. 將沉澱重懸於(yu) Inclusion BodyBinding Buffer中，冰浴1小時，使包涵體(ti) 溶解。
5. 10,000×g離心20分鍾，將上清以孔徑為(wei) 0.45 μm的濾膜過濾。
6. 將蛋白溶液負載上柱，流速為(wei) 10倍柱體(ti) 積/小時。
7. 使用15倍柱體(ti) 積的Inclusion BodyBinding Buffer衝(chong) 洗柱子，收集流穿峰。
8. 使用5倍柱體(ti) 積的Inclusion Body Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。
9. 洗脫後，依次使用3倍柱體(ti) 積的Inclusion BodyBinding Buffer和5倍柱體(ti) 積的去離子水洗滌柱
子，再用3倍柱體(ti) 積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），4℃保存。
注意：在純化包涵體(ti) 蛋白時，所有緩衝(chong) 液均含有變性劑，需要降低 BindingBuffer 中的咪
唑濃度（5mM 或更低）。洗脫時，若蛋白在較高pH下洗脫失敗，可以選用低 pH 緩衝(chong) 液作為(wei) 洗
脫緩衝(chong) 液（pH6.5，pH5.9 或 pH4.5）。 柱再生 當填料使用多次後，結合效率會(hui) 有所下降（表
現為(wei) 流速變慢或填料失去藍綠色），可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質的結
合效率。
1. 使用2 倍柱體(ti) 積的6M 鹽酸胍衝(chong) 洗後，使用3 倍柱體(ti) 積的去離子水衝(chong) 洗。
2. 使用 1 倍柱體(ti) 積2% SDS 衝(chong) 洗。
3. 依次使用 1 倍柱體(ti) 積的25%、50%、75%和5 倍柱體(ti) 積100%乙醇衝(chong) 洗，再依次使用 1 倍柱
體(ti) 積的75%、50%、25%的乙醇衝(chong) 洗。
4. 使用 1 倍柱體(ti) 積的去離子水衝(chong) 洗。
5. 使用 5 倍柱體(ti) 積含50 mM EDTA 緩衝(chong) 液（PH8.0）衝(chong) 洗。
6. 使用 3 倍柱體(ti) 積去離子水，3 倍柱體(ti) 積20%乙醇衝(chong) 洗。
7. 4°C 保存。
8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱體(ti) 積去離子水衝(chong) 洗，然後使用5 個(ge) 柱體(ti) 積的 50 mM NiSO4
再生，3 個(ge) 柱體(ti) 積的Binding Buffer 平衡。
1: 蛋白分子量標準
（分子量由大到小分別為(wei) ：90/66/45/27/ 14.4kDa）
2: 全菌裂解液
3: 流穿收集液
4: 洗脫收集液
1（洗脫緩衝(chong) 液，含 500mM 咪唑，收集第1 個(ge) 柱體(ti) 積）
5: 洗脫收集液
2（洗脫緩衝(chong) 液，含 500mM 咪唑，收集第 2 個(ge) 柱體(ti) 積）
6: 洗脫收集液
3（洗脫緩衝(chong) 液，含500mM咪唑，收集第3 個(ge) 柱體(ti) 積）
7: 洗脫收集液
4（洗脫緩衝(chong) 液，含500mM 咪唑，收集第 4 個(ge) 柱體(ti) 積）
附表
附表 1. 可溶性蛋白純化緩衝(chong) 液配方
成分 Tris-HCl（PH7.9） 咪唑 NaCl
SolubleBindingBuffer 20mM 10mM 0.5M
SolubleElutionBuffer 20mM 500mM 0.5M
附表 2. 包涵體(ti) 蛋白純化緩衝(chong) 液配方
成分 Tris-HCl（PH7.9） 咪唑 NaCl 尿素/鹽酸胍
InclusionBodyBindingBuffer 20mM 5mM 0.5M 8M/6M
InclusionBodyElutionBuffer 20mM 500mM 0.5M 8M/6M
實驗代做服務：
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