氯黴素快速檢測試劑盒說明書(shu)
一、原理
本試劑盒采用間接競爭(zheng) ELISA 方法，在微孔條 上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物氯黴素將和微
孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗氯黴素抗體(ti) ，加入 酶標記物後，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與(yu) 其 所含殘留物氯黴素的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準曲線比 較即可得出相應殘留物氯黴素的含量。
二、試劑盒特性
- 試劑盒靈敏度： 0.05ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～30min～15min
- 樣本檢測下限
蛋類、牛奶（方法一）····························· 0.1 ppb 尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉··················· 0.05ppb 組織、肝髒、蜂蜜、牛奶（方法二）············· 0.025ppb
- 交叉反應率
氯黴素· ······································· 100%
甲碸黴素 ······································ < 0.1%
氟甲碸黴素 ······································ < 0.1%
- 樣本回收率
組織、肝髒 ································ | 85%±20% | ||
蜂蜜、腸衣 ································ | 83%±25% | ||
牛奶、飼料 ································ | 75%±23% | ||
尿液、血清 ································ | 70%±18% | ||
三、試劑盒組成 |
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1 | 微量測試孔 | 每條 8 孔，一板 12 條 | |
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| 標準液×6 瓶 | 0ppb | 0.05ppb |
2 | 0.15ppb | 0.45ppb | |
（1ml/瓶） | |||
| 1.35ppb | 4.05ppb | |
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3 | 酶標記物 | 12ml | 紅色帽 |
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4 | 抗體(ti) 濃縮液 | 1ml | 藍色帽 |
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5 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
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6 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
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8 | 20X 濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
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9 | 2X 濃縮複溶液 | 50ml | 透明帽 |
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四、所用儀(yi) 器、試劑
具備的儀(yi) 器：酶標儀(yi) 、均質器、振蕩器、離心機、 刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮 吹儀(yi) 、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、
多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈、亞(ya) 硝基鐵qing化鈉、
葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)、
硫酸鋅、醋酸鈉、正己烷、醋酸
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試 劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨， 必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實 驗結果。
- 樣本前處理需配製：
配液 1 C 液（牛奶、奶粉樣本）：
10.7g 亞(ya) 硝基鐵qing化鈉加去離子水 100ml 溶解。
配液 2 D 液（牛奶、奶粉樣本）：
28.8g 硫酸鋅加去離子水 100ml 溶解。 配液 3 pH4.8 100mM 醋酸鈉緩衝(chong) 液（尿樣本）：
稱 2.4g 醋酸鈉和 1.2ml 醋酸加去離子水
500ml 溶解混合。
配液 4 乙腈-水溶液：
V 乙腈：VH2O＝84：16
配液 5 樣本複溶液：
將 2X 濃縮複溶液用去離子水按 1：1 稀釋。
| (1 份濃縮複溶掖+1 份去離子水，用於(yu) 抗體(ti) | 氮氣流下幹燥；用 0.5ml 樣本複溶液溶解幹燥 | |
| 的稀釋和樣本提取後的複溶)。 | 的殘留物，混合 30s； | |
u | 樣本處理： | 3、 取 50 µl 用於(yu) 分析。 |
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（a）組織、肝髒樣本處理方法 | 樣本稀釋倍數： 0.5 倍 | ||
1、 稱取均質後的樣本 3±0.05g 於(yu) 50ml 離心管中， | 檢測下限：0.025ppb | 定量下限：0.1 ppb | |
| 先加入 3ml 去離子水混勻後再加入 6ml 乙酸乙 | 注：我們(men) 推薦 0.1 ppb 為(wei) 陽性樣本的 cut off 值。 | |
| 酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min； | （e）腸衣處理方法 |
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2、 取出 4ml 上層液體(ti) 在 50-60℃氮氣流中吹幹； | 1、 用均質器均質樣本；注：幹樣本需剪碎（長度 | ||
3、 加入 1 ml 正己烷溶解幹燥的殘留物，再加 1ml | 不超 5mm）後再均質，濕樣本需用去離子水漂 | ||
| 樣本複溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 | 洗 20min 以上去除表麵的鹽份，瀝幹後再均質； | |
| 5min；去除上層有機相； | 2、 稱 1±0.05g 均質後的樣本於(yu) 50ml 離心管中，加 | |
4、 取 50 µl 下層相用於(yu) 分析。 | 入 10ml 乙酸乙酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min | ||
| 樣本稀釋倍數: 0.5 倍 | 以上離心 10min； |
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（b）血清血漿處理方法 | 3、 取 5ml 上層液體(ti) （相當於(yu) 0.5g 的樣本）在氮氣 | ||
1、 取 1ml 血清或血漿至試管中，加 2ml 乙酸乙酯 | 流下 50-60℃幹燥； |
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| 振蕩 1min；靜置使水相與(yu) 有機相分層或室溫 | 4、 加入 1 ml 正己烷溶解幹燥的殘留物，再加 0.5ml | |
| 4000r/min 離心 5min； | 樣本複溶液振蕩混合 30s，室溫 4000r/min 以上 | |
2、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流 | 離心 5min；除上層有機相； | ||
| 50℃水浴中幹燥；殘留物用 1 ml 樣本複溶液溶 | 5、 取下層 50 µl 用於(yu) 分析。 | |
| 解，混合 30s； | 樣本稀釋倍數： 1 倍 |
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3、 取 50 µl 下層相用於(yu) 分析。 | （f）牛奶樣本處理方法一 |
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| 樣本稀釋倍數: 1 倍 | 1、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處 | |
（c） 尿液處理方法 | 理，吸除上層脂肪；然後取 5ml 去除脂肪奶樣 | ||
1、 移取 2ml 尿液到離心管中，加 pH4.8 100mM 醋 | 至 50ml 離心管中，加入 150µl C 液出現沉澱， | ||
| 酸鈉緩衝(chong) 液 0.5ml 混合；加 40µl 葡萄糖苷酸酶 | 短暫振蕩後加入 150µl D 液混合； | |
| (Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在 37℃ | 2、 15℃4000r/min 以上離心 10min，移取上層液； | |
| 水解至少 2 小時（或過夜）； | 用樣本複溶液以等體(ti) 積稀釋上層液，混合 30s； | |
2、 該溶液恢複至室溫後加入 8ml 乙酸乙酯混合 | 3、 取 50µl 用於(yu) 分析。 |
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| 1min；室溫 4000r/min 離心 10min，取出 4ml | 注：如果離心後仍然渾濁，再重複沉澱過程。 | |
| 上層液體(ti) 在氮氣下 50～60℃幹燥； | 樣本稀釋倍數：2 |
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3、 用 1ml 樣本複溶液溶解幹燥的殘留物，混合 | 檢測下限：0.1ppb | 定量下限：0.15ppb | |
| 30s； | （g）牛奶樣本處理方法二 |
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4、 取 50µl 用於(yu) 分析。 | 1、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處 | ||
| 樣本稀釋倍數: 1 倍 | 理，吸除上層脂肪；然後取 5ml 去除脂肪奶樣 | |
（d）蜂蜜處理方法 | 至 50ml 離心管中，加入 250µl C 液和 250µl D | ||
1、 取 2±0.05 g 蜂蜜，放入離心管中，用 4ml 去離 | 液*混合，4-12℃4000r/min 以上離心 10min。 | ||
| 子水溶解；加入 4ml 乙酸乙酯振蕩 2min，室溫 | 如無冷凍離心機，將樣本置冰箱中冷卻到 8℃； | |
| 4000r/min 以上離心 10min； | 2、 轉移出 2.2ml 上層液（相當於(yu) 2ml 奶樣）至新 | |
2、 移取 2ml 上層清澈液到另一離心管中，50-60℃ | 的離心管中，加入 4ml 乙酸乙酯上振蕩 2min； | ||
室溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min ； 3、 吸取2ml 乙酸乙酯上層液體(ti) （相當於(yu) 1ml 奶樣），
50-60℃氮氣流下*幹燥；用 0.5ml 樣本複溶 液溶解幹燥的殘留物，混合 30s；
4、 取 50µl 用於(yu) 分析。
樣本稀釋倍數：0.5
檢測下限：0.025ppb 定量檢測限：0.05ppb
由於(yu) 陰性樣本可能會(hui) 產(chan) 生背景幹擾 （在某些 情況下幹擾數值在標準 2 到 3 之間），所以推 薦標準 3 作為(wei) 陽性結果的 CUT OFF 判斷值。
（h）奶粉樣本處理方法
1、 稱 2±0.05 g 奶粉至 50ml 離心管中，加入 10ml
去離子水振蕩溶解；加入 1ml C 液和 1ml D 液
*混合；4-12℃4000r/min 以上離心 10min。
若無冷凍離心機，請預先將樣本冷卻到 8℃；
2、 轉移出 3.6ml 上層液（相當於(yu) 0.6g 奶粉）至新 的離心管中，加入 6ml 乙酸乙酯振蕩 5min；室 溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min；
3、 吸取 4ml 乙酸乙酯上層液體(ti) （相當於(yu) 0.4g 奶 粉），50-60℃氮氣流下*幹燥；用 0.4ml 樣
本複溶液溶解幹燥的殘留物，混合 30s； 4、 取 50 µl 用於(yu) 分析。
樣本稀釋倍數：1
檢測下限：0.05ppb 定量檢測限：0.15ppb
由於(yu) 陰性樣本可能會(hui) 產(chan) 生背景幹擾 （在某些情
況下幹擾數值在標準 2 到 3 之間），所以推薦 標準 3 作為(wei) 陽性結果的 CUT OFF 判斷值。
（i）蛋類處理方法
1、 稱取 3±0.05 g 均質的樣本，加入 9ml 乙腈-水溶 液振蕩 2min，15℃4000r/min 以上離心 10min；
2、 取 3ml 上層相與(yu) 3ml 去離子水水混合，加入
4.5ml 乙酸乙酯，混合 1min，15℃4000r/min 以
上離心 10min；取上層有機相置 50-60℃下氮氣 流吹幹；
3、 加入 1ml 正己烷溶解殘留物後，用 2ml 樣本複 溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；
去除上層有機相； 4、 取 50 µl 用於(yu) 分析。
樣本稀釋倍數：
| 檢測下限：0.1ppb | 定量檢測限：0.3ppb | 7、 將孔內(nei) 液體(ti) 甩幹，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔 | |||||
（j）飼料處理方法 |
| 洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙 | ||||||
1、 稱取 2±0.05g 均質過的飼料樣本，加入 2ml 去 | 拍幹（拍幹後未清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺 | |||||||
| 離子水，再加入 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 2min， | 破）。 |
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| 15℃ 4000r/min 以上離心 10min； | 8、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板後置25℃ | ||||||
2、 取 3ml 上層有機相到試管中 56℃下氮氣吹幹； | 環境中反應 30min。將孔內(nei) 液體(ti) 甩幹，用洗滌 | |||||||
3、 加入 1ml 正己烷溶解殘留物，用 1ml 樣本複溶 | 液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍幹（拍 | |||||||
| 液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；去 | 幹後未被清除的氣泡可用幹淨的槍頭刺破）。 | ||||||
| 除上層有機相； |
| 9、 顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B | |||||
4、 取 50 µl 用於(yu) 分析。 |
| 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯 | ||||||
| 樣本稀釋倍數：1 |
| 色 15min。 |
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六、 酶標免疫分析程序: |
| 10、 測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻， | ||||||
| 設定酶標儀(yi) 於(yu) 450nm 處（建議用雙波長 450/63 | |||||||
u | 測定前應須知： |
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| 0nm 檢測，5min 內(nei) 讀數），測定每孔 OD 值。 | |||||||
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 | ||||||||
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| （20～25℃）。 |
| 七、結果判定 |
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2、 使用之後立即將所有試劑放回 2～8℃。 | 結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第 1 種方 | |||||||
3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決(jue) 於(yu) | 法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與(yu) | |||||||
| 洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 | 其所含氯黴素量成負相關(guan) 。 |
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| 程序中的要點。 |
| 1、粗略判定： |
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4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜 | 用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出 | |||||||
| 蓋住微孔板。 |
| 其濃度範圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為(wei) 0.3， | |||||
u | 操作步驟： |
| 樣本 2 的吸光度值為(wei) 1.0，標準液吸光度值分別是： | |||||
1、 從(cong) 2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～ | 0ppb 為(wei) 2.243；0.05ppb 為(wei) 1.816；0.15ppb 為(wei) 1.415； | |||||||
| 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體(ti) 試劑使 | 0.45ppb 為(wei) 0.74；1.35ppb 為(wei) 0.313；4.05ppb 為(wei) 0.155。 | ||||||
| 用前均須搖勻。 |
| 則樣本 1 的濃度範圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2 | |||||
2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放 | 的濃度範圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應的稀 | |||||||
| 入自封袋，保存於(yu) 2-8℃。 | 釋倍數即為(wei) 樣本中氯黴素實際濃度。 | ||||||
3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去 | 2、定量分析 |
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| 離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份 | （1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分 | ||||||
| 去離子水），或按所需用量配製洗滌液。 | 吸光率等於(yu) 標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙 | ||||||
4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每 | 孔）除以第--個(ge) 標準（0 標準）的吸光度值，再乘 | |||||||
| 個(ge) 樣本和標準品做 2 孔平行，並記錄標準孔和 | 以 100%，即 |
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| 樣本孔所在的位置。 |
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| B |
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5、 將濃縮抗體(ti) 用樣本複溶液 11 倍稀釋（1 份抗體(ti) | 百分吸光率（%）＝ | ×100% | ||||||
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| 加入 10 份稀釋液，按需配製使用） | B0 |
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| B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 |
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| 6、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然後加 |
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| B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值 |
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| 加入抗體(ti) 工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕 |
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| （2）標準曲線的繪製與(yu) 計算 |
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| 振蕩混勻。25℃環境中反應 30min。 |
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| 以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以氯黴素標準 |
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品濃度（ng/ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線 圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標準 曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋 倍數即為(wei) 樣本中氯黴素實際濃度。
若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。
八、 注意事項
1、 室溫低於(yu) 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～
25℃）會(hui) 導致所有標準的 OD 值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會(hui) 伴隨著標準曲線不成線性，重複性不好的現象。 所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會(hui) 出現重複性不好的現象。
4、 反應終止液為(wei) 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜 使用會(hui) 引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用 不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質 和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴 露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標 準品 1 的吸光度值小於(yu) 0.5 時，表示試劑可能 變質。
8、 該試劑盒*佳反應溫度為(wei) 25℃，溫度過高或過 低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
九、儲(chu) 藏條件和保質期
1、 儲(chu) 藏條件：試劑盒於(yu) 2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質 期：該產(chan) 品有效期為(wei) 1 年，生產(chan) 日期見 包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正 常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
