鏈黴素

快速檢測試劑盒說明書(shu)

一、原理

本試劑盒采用間接競爭(zheng) ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物鏈黴素將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭(zheng) 抗鏈黴素抗體(ti) ，加入酶標記物後，用TMB底物顯色，樣本吸光值與(yu) 其所含殘留物鏈黴素的含量成負相關(guan) ，與(yu) 標準曲線比較即可得出相應殘留物鏈黴素的含量。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.1ppb
• 孵育溫度：       37℃
• 孵育時間：       30min～30min～15min
• 樣本檢測下限

雞 肉 ··············································  1 ppb

雞肝、牛奶 ······································  4 ppb

蜂 蜜/蜂王漿 ···································  2 ppb

• 交叉反應率

鏈黴素  ··········································   100%

慶大黴素  ······································· ﹤0.1%

雙氫鏈黴素  ····································  108%

卡那黴素  ······································· ﹤0.1%

• 樣本回收率

牛    奶  ····································  85±22%

雞肉組織  ····································  80±22%

蜂蜜/蜂王漿   ······························  75±22%

三、試劑盒組成

四、所用儀(yi) 器、試劑

具備的儀(yi) 器：酶標儀(yi) 、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱、恒溫水浴鍋

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：氫氧化鈉、乙腈、正己烷、三氯yi酸

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免汙染幹擾實驗結果。

• 樣本前處理需配製：

配液1  0.5%三氯yi酸溶液

取0.5g三氯乙suan加去離子水定容100ml。

配液2  3%三氯乙suan溶液

取3g三氯乙suan加去離子水定容100ml。

配液3  1M NaOH溶液：

稱4g NaOH加去離子水定容至100ml。

配液4  0.1M NaOH溶液：

稱0.4g NaOH加去離子水定容至100ml。

配液5  樣本複溶液：

將10X濃縮複溶液用去離子水1：9稀釋。

• 樣本處理：

（a）牛奶處理方法

• 取牛奶1ml，按1:39稀釋，混合30s。（50µl牛奶+1950µl樣本複溶液）
• 取50µl用於分析。

樣本稀釋倍數:  40倍 

（b）雞肉處理方法

• 取2±0.05g去除脂肪的勻漿樣本,加4ml 3%三氯yi酸，充分混勻2min； 室溫4000r/min以上，離心10min；
• 取上清液100µl，加入100µl0.1M NaOH，再加入300 µl樣本複溶液，充分混勻；
• 取50µl用於分析。

樣本稀釋倍數:  10倍 

（c）雞肝處理方法

• 取2±0.05g去除脂肪的勻漿樣本,加6ml 0.5%三氯yi酸和2ml乙腈，充分混勻5min；
• 室溫4000r/min以上，離心10min；
• 取2ml上清液加入2ml正己烷，充分混勻靜置3min，取0.5ml下層清亮液體，室溫4000r/min以上，離心5min；
• 取50µl下層清亮液（若有分層，須去除掉上層液體取下層清亮液體），加入450µl樣本複溶液混勻，混合30s；
• 取50µl用於分析。

    樣本稀釋倍數:  40倍

（d）蜂蜜、蜂王漿處理方法

• 稱量1±0.05g 樣本加入2ml 去離子水，振蕩至*溶解；
• 室溫4000r/min以上離心10 min。
• 取100µl上清液，加入400µl樣本複溶液混勻，混合30s；
• 取50µl用於分析。

樣本稀釋倍數: 10倍 

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
• 使用之後立即將所有試劑放回2～8℃。
• 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存於2-8℃。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配製洗滌液。
• 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
• 加標準品/樣本50µl /孔，然後加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，37℃環境中反應30min。
• 倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。加入250µl/孔洗滌液，15-30s後倒出孔中液體，用吸水紙拍幹，如此重複操作共洗板5次。
• 酶標記物：加入酶標記物100µl/孔，用蓋板膜封板，37℃環境中反應30min。取出酶標板，如前述洗板5次。
• 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，37℃環境中避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀於450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩(liang) 種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與(yu) 其所含鏈黴素量成負相關(guan) 。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與(yu) 標準值比較即可得出其濃度範圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為(wei) 0.3，樣本2的吸光度值為(wei) 1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為(wei) 2.243； 0.1ppb為(wei) 1.816；0.4ppb為(wei) 1.415；1.6ppb為(wei) 0.74；6.4ppb為(wei) 0.313；25.6ppb為(wei) 0.155。則樣本1的濃度範圍是6.4ppb～25.6ppb；樣本2的濃度範圍是0.4ppb～1.6ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中鏈黴素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於(yu) 標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第—個(ge) 標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪製與(yu) 計算

以標準品百分吸光率為(wei) 縱坐標，以鏈黴素標準品濃度（ng/ml）的半對數為(wei) 橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從(cong) 標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為(wei) 樣本中鏈黴素實際濃度。

若利用試劑盒專(zhuan) 業(ye) 分析軟件進行計算，更便於(yu) 大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

• 室溫低於25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會出現重複性不好的現象。
• 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小於0.5時，表示試劑可能變質。
• 該試劑盒jia反應溫度為37℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲(chu) 藏條件和保質期

• 儲藏條件：試劑盒於2～8℃保存，不要冷凍。
• 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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