植物RNA提取試劑盒（DNase I）說明書(shu)

RNApure Plant Kit（DNase I）

植物 RNA 提取試劑盒（DNase I）說明書(shu)

Cat. No.   K0559

保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20  ℃

其它組分：室  溫

組分說明

                                              Cat No.               K0559

                                              Kit Size                 50

                                              DNase I                1000 U

                                        10×Reaction Buffer           1000  μl

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RLC               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2（concentrate）          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Shredder Spin Column             50

                                         Spin Columns RM               50

                                    Collection Tube（1.5 ml）            50

                                     Collection Tube（2 ml）            100

產(chan) 品簡介

    本試劑盒用於(yu) 從(cong) 各種植物中提取純化高品質總 RNA，也適用於(yu) 真菌菌絲(si) RNA 的提取。*的 Shredder 分離柱，用於(yu)

勻質化和過濾高粘度的植物或真菌裂解物，同時采用矽基質膜吸附 RNA 進行純化，使多聚糖等各種汙染物通過洗滌被有效

去除，經洗脫的RNA可直接用於(yu) 各種下遊實驗。由本試劑盒提取RNA分子量大於(yu) 200 堿基，純度高，幾乎無DNA殘留。

如果是對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實驗，殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase 在柱上進行消化去除。提取的 RNA

可用於(yu) Northern Blot、Dot Blot 、RT-PCR 和體(ti) 外翻譯等實驗。

注意事項

1.  預防RNase汙染，應注意以下幾方麵：

    1）使用無RNase的塑料製品和槍頭，避免交叉汙染。

    2）玻璃器皿應在使用前於(yu) 180℃高溫下幹烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鍾，用水*衝(chong) 洗後高壓滅菌。

    3）配製溶液應使用無RNase的水。

    4）操作人員戴一次性kou'zhao和手套，實驗過程中要勤換手套。

2.  提取的樣品避免反複凍融，否則影響 RNA 提取的量和質量。

3.  Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，1 ml Buffer RL 加 10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個(ge) 月。Buffer RLC 使用時不需加β-巰基乙醇。

4.  第-次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5.  Buffer RL 和 Buffer RLC 如果產(chan) 生沉澱，請加熱使其溶解後室溫放置。

6.  所有離心步驟均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。

自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA）  

操作步驟

 1.   50-100 mg植物組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入600 μl Buffer RL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇）或Buffer RLC。渦旋振蕩使其充分裂解。

 注意：1）Buffer RL主要成分為(wei) 異硫氰酸胍，適用於(yu) 大多數植物組織的裂解。但有些植物組織（如玉米的胚乳），由於(yu) 次級代謝產(chan) 物較特殊，異硫氰酸胍使樣品產(chan) 生沉澱，導致RNA提取效果不佳，此時可加入Buffer RLC替代Buffer RL。

 2）56℃孵育1-3分鍾有助於(yu) 組織的裂解，但是澱粉含量高的植物不要進行高溫孵育。

 2.   將步驟1所得全部液體(ti) 轉移至已裝入RNase-Free 2 ml收集管（RNase-Free 2 ml Collection Tube）的Shredder Spin Column中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2分鍾，將收集管中的上清液轉移到一個(ge) 新的離心管（自備）中。

注意：1）在吸取液體(ti) 時可以將槍頭剪掉，便於(yu) 取樣。

2）Shredder Spin Column可以除去大部分的碎片，但仍會(hui) 有小部分流出，離心後會(hui) 在收集管內(nei) 形成沉澱，在進行下一步時注意避免吸到沉澱。

 3.   在步驟2所得幹淨的裂解液中加入0.5倍體(ti) 積的無水乙醇，迅速混勻。

注意：加入乙醇後可能會(hui) 產(chan) 生沉澱，但不影響後續試驗。

 4.   將上步得到的溶液轉移到吸附柱（Spin Columns RM）中（吸附柱已裝入收集管中）,若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩(liang) 次轉入; 10,000 rpm（~8,000 x g）離心15秒，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 5.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鍾，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 6.   配製DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1U/μl），混勻，  配製成終體(ti) 積為(wei) 80 μl的反應液。

 7.   向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分鍾。

 8.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心1分鍾，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 9.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 10,000 rpm離心15秒,棄廢液。

 10. 重複步驟9。

 11. 將吸附柱放回收集管中，12,000 rpm離心1分鍾，將吸附柱置於(yu) 室溫數分鍾，以*晾幹。

     注意：這一步的目的是將吸附柱中殘餘(yu) 乙醇去除，乙醇殘留會(hui) 影響後續的酶促反應(酶切、PCR等)。

 12. 將吸附柱裝入新的RNase-Free 1.5 ml  收集管中，向吸附膜的中間加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鍾，10,000 rpm離心1分鍾，得到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。

 注意：1）  RNase-Free Water 體(ti) 積不應小於(yu) 30 μl，體(ti) 積過小影響回收率。

2）  如果要提高RNA的產(chan) 量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重複步驟12。

3）  如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重複步驟12。

實驗代做服務：