甲硝唑酶聯免疫試劑盒
說明書(shu)
一、藥物概述及檢測原理
甲硝唑抗菌藥，主要用於(yu) 治療和預防滴蟲、阿米巴原蟲及厭氧菌引起的感染。
本公司的甲硝唑酶聯免疫試劑盒使用xing生物技術開發，具有方便、快速、靈敏等特點。
本試劑盒利用甲硝唑抗體(ti) 與(yu) 甲硝唑可產(chan) 生特異性結合的性質，先在酶標板上預包被抗原，再加入標準品（樣本）和甲硝唑抗體(ti) ，樣本或標準品中的甲硝唑藥物與(yu) 固定在酶標板上的抗原競爭(zheng) 甲硝唑抗體(ti) ，再加入酶標記二抗反應，hou加入底物催化顯色。此時顯色深度與(yu) 標準品（樣本）中甲硝唑藥物的含量成反比。
二、試劑盒內(nei) 包含組分：
標準品工作液：0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb，1 mL/瓶。
96孔酶標板：1塊
甲硝唑抗體(ti) 工作液：1瓶（7mL/瓶）
酶標Ⅱ抗工作液：1瓶（12 mL/瓶）
20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）
組織樣品處理液Ⅰ：1瓶（幹粉，選配，如有需求請向廠家索取)
牛奶樣本處理液：1瓶（10ml/瓶，選配，如有需求請向廠家索取）
複溶工作液：1瓶（50 mL/瓶）
底物A液：1瓶（7mL/瓶）
底物B液：1瓶（7 mL/瓶）
終止液：1瓶（7mL）
說明書(shu)
蓋板膜
自封袋
三、用戶需要自備的設備和試劑
儀(yi) 器：
酶標儀(yi) （檢測波長450 nm、630 nm）
電子天平（精度：0.01 g）
離心機（3000 g及以上）
生化培養(yang) 箱（可調4℃，25℃）
搖床
旋渦振蕩器
氮吹儀(yi)
微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）
計時器
試劑：（試劑均為(wei) 分析純）
乙酸乙酯
正己烷
氫氧化鈉
濃鹽酸
四、試劑盒特異性
試劑盒與(yu) 其他甲硝唑藥物的交叉反應率：
v 甲硝唑…………………………………100%
五、樣本檢測步驟
1. 1工作液準備
v 組織樣品處理液Ⅰ：將粉末藥品溶於(yu) 200ml去離子水即得（如有需求請向廠家索取）。
v 組織樣品處理液Ⅱ：準確量取400 mL乙酸乙酯和100 mL正己烷，充分混勻後待用。
v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
v 0.1M NaOH：稱取0.8 g NaOH，加入200 mL去離子水溶解。
v 1M HCL：量取1ml濃鹽酸，加入11mL去離子水溶解混勻。
2. 2樣品前處理
組織（雞肉、豬肉）（稀釋倍數：0.5）
Ø 精確稱取2 g均質後的組織樣品於(yu) 50 mL塑料離心管中；
Ø 加入2 mL組織樣品處理液Ⅰ（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀(yi) 渦動30s）以使處理液Ⅰ與(yu) 樣本充分接觸；
Ø 加入8 mL組織樣品處理液Ⅱ（見5.1），充分震搖（或渦動）3 min（注：若實驗室配置有搖床，可充分震搖1min後使用搖床300rpm 25℃震搖10分鍾）；
Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 取4 mL上清液於(yu) 潔淨的玻璃離心管中；
Ø 使用氮吹儀(yi) 於(yu) 50-60℃水浴中吹幹溶劑；
Ø 加入2 mL正己烷，再加入0.5 mL複溶工作液，強烈震搖1min（或渦動30 s）；
Ø 使用離心機室溫3000 g以上，離心5 min；
Ø 棄去上層正己烷及中間雜質層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；
Ø 取50 μL下層液體(ti) 進行分析。
蜂蜜（稀釋倍數：0.5）
Ø 稱取2.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml塑料離心管中；
Ø 加入2ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），強烈震搖使蜂蜜溶解；
Ø 加入4ml 乙酸乙酯,強烈震搖5min（或使用渦動儀(yi) 渦動3min）使樣本與(yu) 有機相充分接觸；
Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀(yi) 於(yu) 50-60℃水浴中吹幹溶劑；
Ø 加入0.5 mL複溶工作液，強烈震搖2min（或渦動1min）；
Ø 取50 μL下層液體(ti) 進行分析。
原奶方法一（稀釋倍數：5）
Ø 將采樣好的原奶樣本解凍後於(yu) 室溫靜置平衡30min以上；
Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
Ø 加入50μL 1M鹽酸（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀(yi) 渦動30s）；
v 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min；
Ø 取上層清亮液體(ti) 100μL加入另一幹淨離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油），再加入400μL複溶工作液，強烈震搖1min （或使用渦動儀(yi) 渦動30s）；
Ø 取50 μL液體(ti) 進行分析。
原奶方法二（稀釋倍數：1）
Ø 將采樣好的原奶樣本解凍後於(yu) 室溫靜置平衡30min以上；
Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出2ml樣本加入50ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
Ø 加入100μL 牛奶樣本處理液，再加入6ml乙酸乙酯，強烈震搖5min （或使用渦動儀(yi) 渦動1min）；
Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 取1.5 mL上清液於(yu) 潔淨的玻璃離心管中；
Ø 使用氮吹儀(yi) 於(yu) 50-60℃水浴中吹幹溶劑；
Ø 加入1 mL正己烷，再加入0.5 mL複溶工作液，強烈震搖1min（或渦動30 s）；
Ø 使用離心機室溫3000 g以上，離心5 min；
Ø 棄去上層正己烷及中間雜質層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；
Ø 取50 μL下層液體(ti) 進行分析。
生蛋方法一（稀釋倍數：1）
Ø 量取1ml全蛋樣本至50ml塑料離心管中；
Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），8ml 乙酸乙酯,強烈震搖5min（或使用渦動儀(yi) 渦動3min）使樣本與(yu) 有機相充分接觸；
Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 移取4ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀(yi) 於(yu) 50-60℃水浴中吹幹溶劑；
Ø 加入0.5 mL複溶工作液，1ml正己烷，強烈震搖2min（或渦動1min），離心機室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 棄去上層正己烷及中間雜質層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；
Ø 取50 μL下層液體(ti) 進行分析。
生蛋方法二（稀釋倍數：5）
Ø 取出1ml樣本加入2ml離心管中；
Ø 加入100μL 1M鹽酸（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀(yi) 渦動30s）；
Ø 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min；
Ø 取上層清亮液體(ti) 100μL加入另一幹淨離心管中，再加入400μL複溶工作液，強烈震搖1min （或使用渦動儀(yi) 渦動30s）；
Ø 取50 μL液體(ti) 進行分析。
熟蛋（稀釋倍數：2）
Ø 稱取1g熟蛋樣本至50ml塑料離心管中；
Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），8ml 乙酸乙酯,強烈震搖5min（或使用渦動儀(yi) 渦動3min）使樣本與(yu) 有機相充分接觸；
Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀(yi) 於(yu) 50-60℃水浴中吹幹溶劑；
Ø 加入0.5 mL複溶工作液，1ml正己烷，強烈震搖2min（或渦動1min），離心機室溫3000 g以上離心5 min；
Ø 棄去上層正己烷及中間雜質層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；
Ø 取50 μL下層液體(ti) 進行分析。
3. 3檢測
準備：將要使用的酶標板條插入酶標板架上，並記錄各標準品和樣品的位置，為(wei) 減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個(ge) 樣本/標準品點兩(liang) 孔），未使用的酶標板條用自封袋密封後，保存於(yu) 2-8℃環境中以防變質；
加樣：向對應微孔中加入標準品工作液/樣品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL抗體(ti) 工作液；
孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內(nei) 液體(ti) 充分混勻後，蓋好蓋板膜於(yu) 4℃避光反應60 min；
洗滌：取出酶標板後小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體(ti) 後，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s後倒掉洗滌工作液，然後再加入洗滌工作液重複洗滌3~4次後，將酶標板倒置於(yu) 吸水紙上，用力拍幹；
加酶：在每孔中加入100 μL酶標Ⅱ抗工作液（洗滌後的酶標板在加酶前不宜在室溫環境過長時間放置，以防微孔幹燥導致實驗結果差異）；
孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，蓋好蓋板膜於(yu) 25℃避光反應20min；
洗滌：按照前麵敘述的方法再次洗滌酶標板；
顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體(ti) 積1:1充分混合，混合液在10 min內(nei) 使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質失效）；
孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內(nei) 液體(ti) 充分混勻後，蓋好蓋板膜於(yu) 25℃避光反應15 min；
終止：在反應後的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍變黃表明終止成功。
讀數：終止後的酶標板應在5 min內(nei) 用酶標儀(yi) 讀數，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標板吸光度值。
4計算結果
設各標準品（或樣品）的吸光度平均值為(wei) B，零標準（濃度為(wei) 0 ppb的標準品）吸光度平均值B0以(B/B0)×100%為(wei) 各標準品（或樣品）對應的吸光度的百分比：
使用半對數係統代入標準品對應的吸光度的百分比，與(yu) 標準品濃度擬合出標準曲線。
將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中，即可得出樣品對應的濃度，後乘以樣品相應的稀釋倍數，即可得出樣品中檢測物含量。
六、試劑盒參數
Ø 試劑盒靈敏度：0.1 ppb；
Ø 標準曲線範圍：0.1 ppb-8.1 ppb；
Ø 板內(nei) 變異係數：<5%；
Ø 板間變異係數：<15%；
Ø B0吸光度jia值：>0.8；
Ø 回收率：90%±30%
Ø 樣品低檢測限：
豬肉、雞肉…………………………………………約0.5 ppb
蜂蜜…………………………………………………約0.1 ppb
原奶方法一…………………………………………約1 ppb
原奶方法二…………………………………………約0.2ppb
生蛋方法一…………………………………………約0.5 ppb
生蛋方法二…………………………………………約1.5 ppb
熟蛋……………………………………v……………約1 ppb
注：ppb=ng/mL或ng/g。
七、分析限製
本試劑盒為(wei) 定量或半定量試劑盒，建議用於(yu) 大量樣本篩查分析。若檢測結果為(wei) 陽性，建議使用儀(yi) 器方法開展確證實驗（如GC/MS、LC-MS/MS等）。
八、試劑盒貯存條件及有效期
Ø 試劑盒貯存在2-8℃有效期為(wei) 一年，切勿凍存。
Ø 未使用完的酶標板條須密封保存2-8℃的環境中。
九、注意事項
Ø 使用試劑盒前，請務必仔細閱讀說明書(shu) 。
Ø 試劑盒使用前，需將盒內(nei) 各組份置於(yu) 實驗台上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。
Ø 試劑在使用前許搖勻，混合時應避免出現氣泡。
Ø 槍頭為(wei) 一次性用品，為(wei) 防止試劑交叉汙染，檢測過程中所用槍頭不得重複使用。
Ø 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。
Ø 樣品處理完畢後請立即分析，否則可能影響檢測結果。
Ø 底物A液、底物B液均為(wei) 無色透明液體(ti) ，若在使用前已變成藍色，或混合後立即變藍，說明試劑已汙染或變質。
Ø 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應時間差對檢測結果產(chan) 生影響。
Ø 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水衝(chong) 洗。若不shen入眼，請在*清洗後去醫院檢查。
