HiFi-MMLV cDNAdi一鏈合成試劑盒

HiFi-MMLV cDNA Kit

目錄號：K0744

保存條件：-20℃保存。

組分說明

組分說明

 Cat. No.           K0744      K0744A

 Kit Size           25          100

HiFi-MMLV，200 U/μl    25 μl        100 μl

5×RT Buffer         120 μl       500 μl

Primer Mix          60 μl        240 μl

dNTP Mix，2.5 mM Each   120 μl       500 μl

DTT，0.1 M          60 μl        240 μl

RNase-Free Water      1 ml         1 ml

             本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及其他用途  

產(chan) 品簡介

　　本產(chan) 品是專(zhuan) 為(wei) 兩(liang) 步法RT-PCRdi一步實驗配製的cDNAdi一鏈合成試劑盒。本產(chan) 品包

含從(cong) RNA模板逆轉錄成cDNAdi一鏈所需的所有試劑，其中包括HiFi-MMLV逆轉錄酶、

反應緩衝(chong) 液、引物、dNTP等。經過突變改造的HiFi-MMLV逆轉錄酶RNase H活性缺失，

減少了逆轉錄反應中RNA的降解，更容易獲得全長的cDNA。HiFi-MMLV逆轉錄酶熱穩

定性強，可得高產(chan) 量的 cDNA，使用簡單方便。本係統對後續的  PCR以及定量PCR試

驗兼容性高，適用各種PCR反應的DNA聚合酶。

產(chan) 品特點

·RNase H-：經突變的HiFi-MMLV逆轉錄酶，RNase H活性缺失，更易獲得全長cDNA。

·使用方便：試劑盒包含除RNA模板外的逆轉錄所需全部試劑。

注意事項

1．在操作過程中應避免RNase汙染，防止RNA降解或實驗中的交叉汙染，建議在專(zhuan) 門

   的區域進行RNA操作，使用專(zhuan) 門的儀(yi) 器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套並經

   常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時，並在120℃下高壓滅菌30分鍾後使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下幹熱滅菌60分鍾後使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC

   處理後進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，並經短暫離心

   後使用。所涉及的酶類使用後應盡快放回-20℃，避免反複凍融。

4．若起始RNA的量小於(yu) 50  ng，建議加入RNA酶抑製劑（RNasin）。本試劑盒並未提

   供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

使用方法

注意：10 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應體(ti) 係，如果總RNA量大於(yu) 5 μg，請按比例擴大反應體(ti) 係。

 i逆轉錄操作步驟：

1．將RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water

   溶解並置於(yu) 冰上備用。

2．根據以下表格配製反應體(ti) 係，總體(ti) 積為(wei) 20 μl。

試劑                   20 μl反應體(ti) 係      終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each       4μl         500 μM Each

Primer Mix              2μl

RNA Template             Xμl           1 ng-5 µg

5×RT Buffer             4μl              1×

DTT，0.1 M             2μl            10 mM

HiFi-MMLV，200 U/μl                 1  μl

RNase-Free Water               up to 20  μl

注意：1）若起始RNA的量小於(yu) 50 ng，則建議加入RNA酶抑製劑（RNasin）。本試劑盒並未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。

    2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配製而成。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

4．42℃孵育30-50分鍾，85℃孵育5分鍾。反應結束後，短暫離心，置於(yu) 冰上冷卻。

5．逆轉錄產(chan) 物可直接用於(yu) PCR反應和熒光定量PCR反應，或置於(yu) -20℃長期保存。

ii  若逆轉錄效率低，或RNA模板二級結構複雜、GC含量高時，建議采用以下步驟：

1．將RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water

   溶解並置於(yu) 冰上備用。

2．根據以下表格配製反應體(ti) 係，總體(ti) 積為(wei) 13 μl。

試劑                    20 μl反應體(ti) 係     終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each        4 μl         500 μM Each

Primer Mix                2 μl

RNA Template              X μl           1 ng-5 µg

RNase-Free Water               up to 13  μl

3．70℃孵育10分鍾，迅速冰浴2分鍾。

4．短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

5．繼續向以上反應液中加入以下試劑：

試劑               20 μl反應體(ti) 係          終濃度

5×RT Buffer           4 μl               1×

DTT，0.1 M             2 μl             10 mM

 注意：1）若起始RNA的量小於(yu) 50 ng，則建議加入RNA酶抑製劑（RNasin）。本試劑盒並未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

        2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配製而成。

6．輕輕吹打混勻，42℃孵育2分鍾。

7．加入1 μl HiFi-MMLV（200 U/μl），輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鍾。

8．85℃孵育5分鍾。反應結束後，短暫離心，置於(yu) 冰上冷卻。

9．逆轉錄產(chan) 物可直接用於(yu) PCR反應和熒光定量PCR反應，或置於(yu) -20℃長期保存。

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