貨號:YJ2445 規格：25管/24樣
線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅲ試劑盒說明書(shu)
可見分光光度法
正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定
測定意義(yi)
線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅲ（EC1.10.2.2） 又稱 CoQ-細胞色素C還原酶，廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞的線粒體(ti) 中，是線粒體(ti) 呼吸電子傳(chuan) 遞鏈主路和支路的共有成分，負責把還原型 CoQ 的氫傳(chuan) 遞給細胞色素C，生成還原型細胞色素C。
測定原理
與(yu) 氧化型細胞色素C不同，還原型細胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅲ酶活性。
需自備的儀(yi) 器和用品
可見分光光度計、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配製
試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體(ti) 20mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑六：液體(ti) 2.5mL×1 瓶，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與(yu) 線粒體(ti) 蛋白的分離：
1、準確稱取0.1g組織或收集500萬(wan) 細菌或細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g，4℃離心 5min。
3、棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、上清液即為(wei) 除去線粒體(ti) 的胞漿蛋白，可用於(yu) 測定從(cong) 線粒體(ti) 泄漏的複合體(ti) Ⅲ（此步可選
做）。
5、步驟④中的沉澱即為(wei) 線粒體(ti) ，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重複30次），用於(yu) 複合體(ti) Ⅲ酶活性測定。
測定步驟：
1、分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 550nm，蒸餾水調零。
2、樣本測定
（1）工作液的配製：臨(lin) 用前把試劑五轉移到試劑四中混合溶解，置於(yu) 37℃（哺乳動物）或
25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑 4℃可保存一周；
（2）在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、100μL 試劑六和 800μL 工作液，立即混勻，
記錄 550nm 處初始吸光值 A1 和 2min 後的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1。
複合體(ti) Ⅲ活力單位的計算：
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1 nmol還原型細胞色素C定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。
複合體(ti) Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T
=615×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義(yi) ：每 g 組織每分鍾催化產(chan) 生 1nmol 還原型細胞色素 C 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。
複合體(ti) Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)
÷T=124×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾催化產(chan) 生1nmol還原型細胞色素C定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。
複合體(ti) Ⅲ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.248×ΔA
V 反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，9.4×10-4 L；ε：細胞色素 C 摩爾消光係數，1.91×104L/mol/cm；
d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體(ti) 積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；
T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬(wan) 。
