貨號:YJ2445 規格：25管/24樣
線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅱ試劑盒說明書(shu)
可見分光光度法
正式測定前務必取 2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定
測定意義(yi)
線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶，廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞的線粒體(ti) 中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時輔基 FAD 還原為(wei) FADH2，後者進一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q，是呼吸電子傳(chuan) 遞鏈的支路。
測定原理
複合體(ti) Ⅱ的催化產(chan) 物還原型輔酶Q可進一步還原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰，通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計算該酶活性。
需自備的儀(yi) 器和用品
可見分光光度計、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配製
試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體(ti) 25mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑七：液體(ti) 2.5mL×1 瓶，4℃保存；
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與(yu) 線粒體(ti) 蛋白的分離：
1、 準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬(wan) 細菌或細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
3、 棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
4、 上清液即為(wei) 除去線粒體(ti) 的胞漿蛋白，可用於(yu) 測定從(cong) 線粒體(ti) 泄漏的複合體(ti) Ⅱ（此步可選
做）。
5、 步驟④中的沉澱即為(wei) 線粒體(ti) ，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲3s，間隔10秒，重複30次），用於(yu) 複合體(ti) Ⅱ酶活性測定。
測定步驟：
1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長至605nm，蒸餾水調零。
2、 樣本測定
（1）工作液的配製：臨(lin) 用前把試劑五和試劑六轉移到試劑四中混合溶解，置於(yu) 37℃（哺乳
動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑 4℃可保存一周；
（2）在1mL 玻璃比色皿中加入40μL樣本、100μL試劑七和800μL工作液，立即混勻，記錄 605nm處初始吸光值A1和2min後的吸光值A2，計算 ΔA=A1-A2。
複合體(ti) Ⅱ活力單位的計算
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義(yi) ：每 mg 組織蛋白每分鍾消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。
複合體(ti) Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T
=559×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。
複合體(ti) Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=113×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。
複合體(ti) Ⅱ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.226×ΔA
V 反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，9.4×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光係數，2.1×104L/mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體(ti) 積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；
T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細
菌總數，500 萬(wan) 。
