貨號：YJ2319                                                   規格：25管/12樣

線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅴ試劑盒說明書(shu)

可見分光光度法

正式測定前務必取 2-3 個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅴ又稱F₁F₀-ATP合酶，廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞的線粒體(ti) 中，由F1和F0兩(liang) 個(ge) 亞(ya) 單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chan) 生的質子電化學梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，複合體(ti) Ⅴ還存在於(yu) 葉綠體(ti) 、異養(yang) 菌和光合細菌中。複合體(ti) Ⅴ是線粒體(ti) 氧化磷酸化和葉綠體(ti) 光合磷酸化合成ATP的關(guan) 鍵酶。

測定原理

複合體(ti) Ⅴ水解ATP產(chan) 生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定複合體(ti) Ⅴ活性。

需自備的儀(yi) 器和用品

可見分光光度計、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸

餾水。

試劑的組成和配製

試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：25mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1 mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；臨(lin) 用前每支加入1.3mL 蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五：6mL×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨(lin) 用前加入3mL蒸餾水，充分混勻；溶解後 4℃保存一周；

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨(lin) 用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解後4℃保存一周；

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨(lin) 用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解後4℃保存一周；

試劑九：液體(ti) 10mL×1 瓶，室溫保存。

定磷試劑的配製：按 H₂O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1的比例配製，配好的定磷試劑應為(wei) 淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為(wei) 磷汙染（請根據需要，用多少配多少）。

注意：配試劑hao用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷汙染。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與(yu) 線粒體(ti) 蛋白的分離：

① 準確稱取0.1g組織或收集500萬(wan) 細菌或細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g，4℃離心 5min。

③ 棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

④ 上清液即為(wei) 除去線粒體(ti) 的胞漿蛋白，可用於(yu) 測定從(cong) 線粒體(ti) 泄漏的複合體(ti) Ⅴ（此步可選做）。

⑤ 步驟④中的沉澱即為(wei) 線粒體(ti) ，加入800uL試劑二和8uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重複30次），用於(yu) 複合體(ti) Ⅴ酶活性測定。

測定步驟

• 酶促反應

混勻，4000g，25℃離心 10min，取上清液

• 定磷

混勻，室溫靜置10min左右，在660nm處讀 A測定管和A對照管，計算ΔA=A 測定管-A對照管。

複合體(ti) Ⅴ活性計算

標準條件下測定的回歸方程為(wei) y = 1.2487x + 0.0361；x為(wei) 標準品濃度（mmol/L），y為(wei) A值。

1、組織中複合體(ti) Ⅴ活性的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾產(chan) 生1nmol無機磷定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

複合體(ti) Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(V 樣×Cpr) ÷T=64×(ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每 g 組織每分鍾產(chan) 生1 nmol 無機磷定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

複合體(ti) Ⅴ活性（nmol/min/g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V反總×10⁶]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T=51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾產(chan) 生1nmol無機磷定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

複合體(ti) Ⅴ活性（nmol/min/10⁴cell）=[(ΔA-0.0361)÷1.2487×V反總×10⁶]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×(ΔA-0.0361)

V 反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，6×10^-4 L；V 樣：加入樣本體(ti) 積，0.25 mL；V 樣總：加入提取液體(ti) 積，0.808 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬(wan) 。