貨號: YJ2273                                                    規格：25管/24樣

線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅳ試劑盒說明書(shu)

可見分光光度法

產(chan) 品內(nei) 容：

試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑四：液體(ti) 10mL×2 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×2 支，-20℃保存；

產(chan) 品說明：

    線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅳ又稱細胞色素C 氧化酶，也是線粒體(ti) 呼吸電子傳(chuan) 遞鏈主路和支路的共有成分，負責催化還原型細胞色素C 的氧化，並終把電子傳(chuan) 遞給氧，生成水。還原型細胞色素C 在550nm 有特征光吸收，線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅳ催化還原型細胞色素C 生成氧化型細胞色素C，因此550nm 光吸收下降速率能夠反映線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅳ酶活性。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

正式實驗前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做與(yu) 測定。

一、樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與(yu) 線粒體(ti) 蛋白的分離：

1. 準確稱取0.1g 組織或收集500萬細菌或細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2. 將勻漿600g，4℃離心5min。
3. 棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。
4. 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用於測定從線粒體泄漏的複合體Ⅳ（此步可選做）。
5. 步驟④中的沉澱即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重複30次），用於複合體Ⅳ酶活性測定。

二、測定步驟：

1. 分光光度計預熱30min以上，調節波長至550nm，蒸餾水調零。
2. 樣本測定

1. 工作液的配製：臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支，將試劑五和試劑六依次轉移到試劑四中混合溶解。分批配製工作液是為了防止當天不能測完，導致工作液失效。
2. 將工作液置於37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑4℃可保存一周；
3. 在1mL 玻璃比色皿中加入40μL 樣本和800μL 工作液，立即混勻，記錄550nm 處初始吸光值A1 和 1min 後的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：若ΔA 大於(yu) 0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當倍數（計算公式中乘以相應稀釋倍數），使A1-A2 小於(yu) 0.2，可提高檢測靈敏度。

三、複合體(ti) Ⅳ活力單位的計算：

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg 組織蛋白每分鍾催化降解1 nmol 還原型細胞色素C 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

複合體(ti) Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

1. 按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g 組織每分鍾催化降解1nmol 還原型細胞色素C 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

複合體(ti) Ⅳ活力(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=222×ΔA÷W

1. 按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1 萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾催化降解1nmol 還原型細胞色素C 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

複合體(ti) Ⅳ活力(U/10⁴ cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.444×ΔA

    V 反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，8.4×10^-4 L；ε：細胞色素C 摩爾消光係數，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體(ti) 積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬(wan) 。

書(shu)