神經HRP示蹤顯色液(TMB法)說明書(shu)

上個(ge) 世紀 70 年代，Kristensopn 和 Olsson 報道了HRP可神經末梢攝取，經軸漿逆行運輸至神經元胞體(ti) ，經組織化學方法可顯示出神經元的輪廓，從(cong) 而開發出 HRP  追蹤神經元示蹤技術，即為(wei) HRP 法。3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)是非常優(you) 越的酶免試驗顯色劑，能

溶解於(yu) 多種有機溶劑和雙蒸水中，為(wei) 穩定的無色溶液，不適量過氧化脲或雙氧水不緩衝(chong) 液混   勻後，不過氧化物酶作用產(chan) 生清晰的藍色產(chan) 物，極易觀察，在辣根過氧化物酶的催化下 , TMB 會(hui) 產(chan) 生藍色沉澱，該沉澱不溶於(yu) 水和乙醇，顯色後呈藍色，可在顯微鏡下觀察。

神經 HRP 示蹤顯色液(TMB 法)是動物經麻醉、注入HRP後，遊離或絡合型的 HRP 不氧化劑反應生成絡合物，該絡合物氧化供氫的 TMB 顯色劑，呈藍色，在顯微鏡下清晰可見，該檢測法較 DAB  法靈敏。該顯色液僅(jin) 用於(yu) 科研領域，不宜用於(yu) 臨(lin) 床診斷或其他用途。

操作步驟(僅(jin) 供參考)：

 (一)、準備工作

1、動物麻醉：多用(3.5%)戊巴比托妥鈉作為(wei) 麻醉劑，大鼠的麻醉劑量為(wei) 0.25-0.35ml/100g。

2、導入HRP：有壓力注射法、電泳法以及周圍神經係統的注射塗抹等法。

3、確定動物存活期。

4、動物灌注：麻醉後，經左心室升主動脈插管行心內(nei) 灌注固定。先用生理鹽水或 PBS 快速灌注。隨後用 4%的多聚甲醛固定液灌注，先快後慢，時間控製在 30-40min。後用 10% 蔗糖磷酸緩衝(chong) 液(pH7.4)。

5、取材：取組織置於(yu) 20%的蔗糖磷酸鹽緩衝(chong) 液中，切片厚度 40μm，存於(yu) 蔗糖磷酸鹽緩衝(chong) 液備用。

(二)、顯色反應

1、配製TMB孵育液：取適量的TMB assay buffer 和TMB顯色液，按 TMB assay buffer： TMB顯色液=39:1 的比例混合，即為 TMB孵育液，即配即用，不宜保存。

2、配製TMB顯色工作液：取適量的TMB孵育液和TMB增強劑，按TMB孵育液：TMB 增強劑=2000～8000：1 的比例混合(具體(ti) 比例應根據具體(ti) 時間摸索確定)，即為(wei) TMB顯色工作液，即配即用，不宜保存。

3、配製 1×TMB Wash buffer：取適量的TMB Wash buffer(20×)，按TMB Wash buffer： 蒸餾水=1:19 的比例混合，即為(wei) 1×TMB Wash buffer。室溫保存6個(ge) 月有效。

4、切片用蒸餾水清洗 3 次，每次 2min。

5、切片入10ml TMB孵育液(提前 20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動。

6、切片入10ml TMB 顯色工作液(提前 20℃溫育)，避光孵育 20min，其間不斷晃動。7、漂洗：取10ml左右的1×TMB Wash buffer 漂洗切片2-3 次，每次 5min。

8、貼片，載玻片用鉻明礬明膠包被，室溫空氣幹燥。

9、脫水、透明步驟按如下操作：

①蒸餾水 10s

②70%乙醇  10s

③95%乙醇  10s

④100%乙醇 2 次，每次 10s

⑤二甲苯2次，每次 2～5min。

1. 中性樹膠封片，顯微鏡下觀察藍色反應。

 注意事項：

1、如果出現高的反應背景或沉澱，表明TMB底物反應過於(yu) 強烈。

2、所用器皿必須潔淨，避免含有氧化劑或還原劑，否則會(hui) 產(chan) 生非特異性反應。

3、TMB顯色液避免反複凍融，以免顯色效率下降。

4、TMB增強劑注意密閉保存，否則顯色效率下降。

有效期： 12 個(ge) 月內(nei) 有效。