怎樣提高ELISA的敏感性—ELISA放大係統

為(wei) 了提高ELISA的敏感性,在ELISA中人們(men) 采用不同的放大機製,建立在ELISA的幾類放大係統.現在向讀者介紹幾個(ge) 比較重要的ELISA放大係統.

   一,生物-親(qin) 和素係統(Biotin-Avidin System,簡稱BAS)

   生物素與(yu) 抗生物素之間具有*的親(qin) 和力,可以縮短反應時間,達到快速檢測的目的.另外,抗體(ti) 和酶的生物素標記率高,又不影響其活性,每個(ge) 親(qin) 和素分子能結合4個(ge) 生物素,每個(ge) 生物素能標記大量酶分子,使得ELISA的敏感性大大提高,生物素與(yu) 親(qin) 和素的結合也極為(wei) 穩定,不會(hui) 在洗滌過程中脫落.BA-ELISA是在常規ELISA的基礎上,結全生物素(Biotin)與(yu) 親(qin) 和素(Avidin)的高度放大作用,形成的一種檢測方法.BA-ELISA分為(wei) :

1,LAB法即酶聯親(qin) 和素-生物素標記法(Labeled avidin-biotin,簡稱LAB).用辣根過氧化物酶直接標記親(qin) 和素,用生物素標記第二抗體(ti) .

2,ABC法即酶聯親(qin) 和素-生物素-過氧化物酶複合物法(Avidin-Biotin-Peroxidase Complex,簡稱ABC).如用鏈黴親(qin) 和素(Streptavidin),則形成鏈黴親(qin) 和素-酶聯生物素複合物(Streptavidin-Biotin-Peroxidaes Complex,簡稱SABC).在ABC法中,用生物素標記第二抗體(ti) ,又用生物素標記過氧化物酶.在使用前30min,親(qin) 和素與(yu) 酶聯生物素以1:1的比例混勻.1個(ge) 親(qin) 和素分子結合3個(ge) 生物素分子,親(qin) 和素剩下的1個(ge) 結合點與(yu) 標記第二抗體(ti) 的生物素結合,親(qin) 和素起橋聯作用.ABC法比PAP(Peroxidase-antiperoxidase tech-nique)法敏感幾十倍.

3,BAB法即酶聯親(qin) 和素-生物素橋法(Bridged avidin-biotin,簡稱BAB).用遊離親(qin) 和素(或鏈黴親(qin) 和素)作為(wei) 橋聯劑,將生物素標記後開成的複合物與(yu) 酶標記生物素連結起來,然後進行樣品的檢測.由於(yu) 標記抗體(ti) 分子上連有多個(ge) 生物素,因此,終形成的抗原-生物素標記抗體(ti) -親(qin) 和素-酶標生物素複合物可積聚大量的酶分子;加入相應底物後,產(chan) 生強烈的酶促反應,大幅度提高檢測的靈敏度.

二,堿性磷酸酶放大係統

堿性磷酸酶廣大係統包含多種放大機製:堿性磷酸酶不直接催化底物生成有色產(chan) 物而是催化生成輔酶I(NAD+),輔酶I激活下一輪氧化還原反應,輔酶I啟動的反應為(wei) 底物的顏色化學轉變提供條件.在供氫體(ti) 的作用下,底物氧化/還原發生顏色變化.

三,微粒放大係統

每個(ge) 適當的微粒表麵可以同時結合(或吸附)大量的標記酶和抗體(ti) 分子.在包含微粒放大係統的夾心ELISA法中,微粒通過結合於(yu) 其上的第二抗體(ti) 結合於(yu) 抗體(ti) .同時微粒上又結合著標記酶,其數量大大多於(yu) 第二抗體(ti) 能結合的標記酶,從(cong) 而得以放大.

四,催化的顯示劑沉積

催化的顯示劑沉積(Catalyzed reporter deposition,簡稱CARD).CARD依次使用三套顯示劑:套顯示劑是聯在抗體(ti) 上的HRP,它通過抗體(ti) 與(yu) 待測抗原的反應結合於(yu) 固相表麵;第二套顯示劑是標有生物素的苯酚,它受到顯示劑的氧化催化後沉積於(yu) 固相表麵;第三套顯示劑是標在鏈黴親(qin) 和素(Streptavidin)上的AP,可被固相上的生物素捕獲,放大效果非常大.