人細胞凋亡酶聯免疫檢測(ELISA)

試劑盒使用說明書(shu)

• 僅用於科研，不得用於臨床診斷！
• 用於定量檢測人血清、血漿及其他相關液體樣本中細胞凋亡的含量。
• 有效期：6個月。
• 保存條件：2-8℃

使用前請仔細閱讀說明書(shu) ！

實驗原理：

本試劑盒應用生物素雙抗體(ti) 夾心法測定樣品中人細胞凋亡水平。向預先包被了人細胞凋亡單克隆抗體(ti) 的酶標孔中加入細胞凋亡，溫育；溫育後，加入生物素標記的抗細胞凋亡抗體(ti) 。再與(yu) 鏈黴親(qin) 和素-HRP結合，形成免疫複合物，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然後加入底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細胞凋亡呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人細胞凋亡的濃度。

試劑盒組成

注意事項：

• 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
• 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
• 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控製在5分鍾內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
• 請每次測定的同時做標準曲線，做複孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定，計算時請zui後乘以總稀釋倍數（×n）。
• 封板膜隻限一次性使用，以避免交叉汙染。
• 底物請避光保存。
• 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
• 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
• 本試劑不同批號組分不得混用。

需要而未提供的試劑和器材：

• 37℃恒溫箱。
• 標準規格酶標儀。
• 精密移液器及一次性吸頭
• 蒸餾水，
• 一次性試管
• 吸水紙

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鍾，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為(wei) 抗凝劑，混合10-20分鍾後，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yang) 上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nei) 的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬(wan) /ml左右。通過反複凍融，以使細胞破壞並放出細胞內(nei) 成份。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測，其餘(yu) 冷凍備用。

6. 標本采集後盡早進行提取，提取按相關(guan) 文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於(yu) -20℃保存，但應避免反複凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑製辣根過氧化物酶的（HRP）活性。。

操作程序

• 標準品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。)

• 根據代測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做複孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用複孔的盡量做複孔。
• 將稀釋好的標準品按照濃度由高到低或者由低到高依次加入酶標包被板孔中。
• 分別設空白孔（空白對照孔不加樣品、生物素標記的抗Apoptosis抗體及鏈黴親和素-HRP，其餘各步操作相同）及待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40μl，然後再加生物素標記的抗Apoptosis抗體10μl。加樣時將樣品加於酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
• 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾。
• 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋後備用。
• 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。
• 加酶：每孔加入鏈黴親和素-HRP 50μl，空白孔除外。
• 溫育：操作同5。
• 洗滌：操作同7。
• 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鍾. 
• 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
• 測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後10分鍾以內進行。

實驗操作流程圖：

計    算：

以標準物的濃度為(wei) 橫坐標，OD值為(wei) 縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與(yu) OD值計算出標      準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數，即為(wei) 樣品的實際濃度。